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人Midkine的克隆、原核表达、纯化及其调控小鼠骨髓造血的实验研究

2020-11-29阅读(421)

人Midkine的克隆、原核表达、纯化及其调控小鼠骨髓造血的实验研究

论文摘要

中期因子（Midkine,简称MK）是一种肝素结合性生长分化因子。在胚胎期,MK在组织中广泛分布,在成人体内,其表达降低,仅局限于某些特定部位,MK受体种类繁多,信号通路复杂多样,这就决定了MK功能的多样化,它能促进很多种类细胞的生长、存活、分化和迁移,具有抗细胞凋亡的作用,不仅与肿瘤发生密切相关,而且在很多组织的发育形成及损伤后的修复再生过程均有参与,MK已成为恶性肿瘤在内的多种疾病治疗中颇具前景的分子靶点。应用全基因组表达芯片,我们对小鼠骨髓再生过程中骨髓全基因组表达谱作了系统研究,发现中期因子Midkine的表达呈现显著的先上升后下降的趋势,我们预测MK的基因表达与骨髓损伤和修复相关。本课题拟制备人Midkine重组蛋白,研究其对小鼠骨髓造血的调控作用。本研究从该基因克隆开始,构建了原核表达重组质粒,在大肠杆菌中进行蛋白的诱导表达,经过蛋白变性与复性后,经阳离子交换层析过柱纯化,通过Western Blot鉴定了该重组蛋白,并测定重组蛋白的生物学活性和内毒素含量。将重组蛋白注射正常小鼠,研究其对骨髓造血的调控作用。本研究的主要结果和结论如下:通过PCR方法从人骨髓cDNA文库中克隆得到人中期因子Midkine成熟肽目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳验证片段大小约380bp大小,将回收产物克隆到pET30a（+）空载体中构建重组质粒pET30a（+）-hMidkine;转化到非表达宿主菌DH5α后,菌落PCR方法和酶切法筛选鉴定,测序证明与Midkine成熟肽基因序列一致。将重组质粒pET30a（+）-hMidkine转化大肠杆菌BL21（DE3）中,经过蛋白表达的优化,确定最佳的诱导条件为42℃诱导3小时,Kana浓度为100ug/mL的LB培养基,IPTG浓度为1mmol/L。用IPTG诱导400mL菌液,蛋白主要以包涵体形式存在,分子量大小16kDa。离心获得菌体,经超声和溶菌酶双重破菌后,洗涤包涵体,用6M盐酸胍进行包涵体变性,在pH7.4的复性液中进行稀释复性,复性后的蛋白溶液PH调为8.0,经Sp-Sepharose阳离子交换层析后获得目的蛋白溶液。BSA蛋白定量法测得其浓度可达0.8mg/mL,银染和SDS-PAGE鉴定结果表明重组蛋白纯度大于99%,计算蛋白得率,400mL初始菌液获得了9.3mg的重组蛋白。测定重组蛋白的内毒素含量和生物学活性,用显色基质鲎试剂盒测定蛋白的内毒素含量小于0.2EU/ug,通过MTT法检测表明rhMK蛋白具有体外促小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖的活性。用重组蛋白注射正常小鼠进行药效学研究,结果发现Midkine重组蛋白作用后小鼠的外周血白细胞和血小板显著升高,而骨髓细胞总数显著降低,提示外源性hMidkine在小鼠体内可能促进了骨髓细胞向外周血迁移,hMidkine也可能具有动员骨髓造血干祖细胞到外周血的功能。本课题为进一步研究Midkine在调节骨髓造血系统的作用和作用机理奠定了实验基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 第二章 材料
  • 2.1 实验仪器与设备
  • 2.2 主要试剂与配制
  • 2.2.1 常规试剂
  • 2.2.2 质粒与菌株
  • 2.2.3 细菌培养基
  • 2.2.4 蛋白电泳缓冲系统
  • 2.2.5 重组蛋白分离纯化溶液
  • 2.2.6 质粒提取溶液配制
  • 2.2.7 Western blot 相关试剂的配制
  • 2.2.8 内毒素测定相关溶液及试剂
  • 2.2.9 动物实验相关材料
  • 2.2.10 流式细胞仪检测细胞周期相关试剂和材料
  • 2.2.11 造血祖细胞集落培养相关试剂和溶液配制
  • 第三章 方法
  • 3.1 hMidkine 的克隆、表达、纯化与生物活性分析
  • 2法）'>3.1.1 感受态细胞制备（CaCl2法）
  • 3.1.2 大肠杆菌转化
  • 3.1.3 pET30a（＋）质粒抽提（碱裂解法）
  • 3.1.4 hMK PCR 引物设计
  • 3.1.5 PCR 反应
  • 3.1.6 DNA 琼脂糖凝胶电泳
  • 3.1.7 PCR 产物割胶回收
  • 3.1.8 hMK 片段与pTA2 vector 的连接
  • 3.1.9 质粒酶切
  • 3.1.10 目的基因片段和载体片段连接
  • 3.1.11 连接产物转化大肠杆菌
  • 3.1.12 双酶切检测目的基因和测序
  • 3.1.13 pET30a（＋）-hMK 重组质粒转化BL21 菌株
  • 3.1.14 hMK 诱导表达条件优化
  • 3.1.15 hMK 的诱导表达
  • 3.1.16 包涵体的分离和洗涤
  • 3.1.17 包涵体的变性和复性
  • 3.1.18 Sp-Sephorose 阳离子交换层析
  • 3.1.19 Bradford 法测蛋白溶液浓度
  • 3.1.20 蛋白样品SDS-PAGE
  • 3.1.21 Western blot 检测前述强离子交换柱纯化的蛋白的抗原性
  • 3.1.22 SDS-PAGE 及银染法分析前述强离子交换柱纯化的人MK 重组蛋白的纯度
  • 3.1.23 人MK 重组蛋白生物学活性测定
  • 3.1.24 显色基质法测蛋白内毒素含量
  • 3.2 phCMV 和mMidkine 质粒的制备
  • 3.2.1 phCMV-mMK 的克隆
  • 3.2.2 质粒大量抽提
  • 3.2.3 用分光光度计测双链DNA 的浓度
  • 3.3 动物实验
  • 3.3.1 phCMV-mMK 质粒注射正常小鼠
  • 3.3.2 外周血检测
  • 3.3.3 骨髓细胞采集及计数
  • 3.3.4 重组蛋白rhMK 注射正常小鼠
  • 3.3.5 股骨切片及HE 染色
  • 3.3.6 流式细胞仪检测骨髓单个核细胞周期
  • 3.3.7 造血祖细胞集落培养
  • 第四章 结果
  • 4.1 hMK 的基因克隆及蛋白表达纯化结果
  • 4.1.1 PCR 产物扩增结果
  • 4.1.2 hMK-pTA2 酶切及测序结果
  • 4.1.3 pET30a（+）-hMK 酶切鉴定结果
  • 4.1.4 hMK 诱导条件的优化
  • 4.1.5 hMK 重组菌诱导表达后包涵体的准备
  • 4.1.6 包涵体的溶解及蛋白变性复性结果
  • 4.1.7 hMK 过Sp-Sepharose 柱纯化结果
  • 4.1.8 重组hMK 蛋白的SDS-PAGE 电泳鉴定
  • 4.1.9 蛋白样品的透析
  • 4.1.10 纯化得到的rhMK 蛋白纯度验证
  • 4.1.11 Bradford 法测定重组蛋白的浓度
  • 4.1.12 纯化过程中蛋白产量和得率的计算
  • 4.1.13 Western blot 检测纯化得到的蛋白的抗原性
  • 4.1.14 重组蛋白rhMK 活性测定结果
  • 4.1.15 重组蛋白内毒素含量测定
  • 4.2 动物实验结果
  • 重组hMK 蛋白注射正常小鼠后对骨髓造血系统的作用
  • 第五章 讨论
  • 参考文献
  • 文献综述
  • 参考文献
  • 致谢
  • 硕士期间发表的论著

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