导读:本文包含了表达元件论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:地衣芽胞杆菌,碱性丝氨酸蛋白酶,启动子,信号肽
表达元件论文文献综述
饶忆,师璐,王豪,熊世颉,蔡冬波[1]（2019）在《通过优化表达元件及培养基组分提高地衣芽胞杆菌中碱性丝氨酸蛋白酶产量》一文中研究指出【背景】碱性丝氨酸蛋白酶(Subtilisin)是一种具有广泛用途的工业酶制剂。【目的】旨在通过优化启动子、信号肽及培养基组分来提高地衣芽胞杆菌中碱性丝氨酸蛋白酶产量。【方法】以地衣芽胞杆菌BL10为出发菌株,构建了含有4种不同类型启动子(PbacA、P43、PaprE和PsrfA)及4种不同类型信号肽(SPVpr、SPSacB、SPSacC和SPAprE)的碱性丝氨酸蛋白酶表达菌株,并在获得高产菌株的基础上进行培养基优化。【结果】4种启动子的表达水平为PbacA>PaprE>P43>PsrfA,4种信号肽的分泌效率为SPAprE>SPSacC>SPSacB>SPVpr。其中,菌株BL10/pPbacA-aprE产生最高的碱性丝氨酸蛋白酶酶活(275.21 U/mL),相比于出发菌株BL10/pHY-aprE (167.98 U/mL)提高了64%。随后,通过对发酵培养基成分进行优化并结合正交优化,获得了一种高产碱性丝氨酸蛋白酶的培养基(g/L):玉米淀粉40.0,豆粕50.0,(NH4)2SO4 4.0,K2HPO4 3.0,CaCO3 1.0。最后,碱性丝氨酸蛋白酶酶活提高到747.37 U/mL,是初始酶活的4.45倍。【结论】为工业化高产碱性丝氨酸蛋白酶提供了一种有效策略。(本文来源于《微生物学通报》期刊2019年06期）
王慧[2]（2018）在《解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens K11高效表达体系的建立及其高效表达元件的优化》一文中研究指出解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是多种重要饲用酶制剂的生产菌株,因其具有较强的蛋白分泌能力,其在作为高效表达宿主菌方面具有巨大的发展潜力及应用前景。然而,解淀粉芽孢杆菌中存在的限制修饰系统、质粒稳定性差、表达元件缺乏以及内源蛋白酶活力高等问题严重限制了其在基因工程研究中的广泛应用。本研究的核心材料解淀粉芽孢杆菌K11(B.amyloliquefaciens K11)是一株高产中性蛋白酶和角蛋白酶的菌株。前期通过转化条件的摸索和质粒结构元件的优化,已较好的解决了 K11菌株遗传和质粒稳定性差的难题,为将K11菌株开发成为高效的异源蛋白表达宿主奠定了坚实的基础。本研究以解淀粉芽孢杆菌K1 1为宿主菌、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BcaprE作为报告基因,通过高产酶蛋白的工业菌株的强启动子(PamyQ、PaprE、Pnpr)和高效分泌信号肽(SPamyQ、SPaprE、SPnpr)的优化组合,筛选适用于K11菌株高效分泌表达外源蛋白的通用表达元件。摇瓶测试结果显示:在以α-淀粉酶基因启动子PamyQ、碱性蛋白酶基因信号肽SPaprE组成的表达元件调控下,碱性蛋白酶基因BcaprE在解淀粉芽孢杆菌K11中的胞外分泌表达水平为最高,可达13804U/mL。该优化组合元件PamyQ-SPaprE,同样也能够有效的引导生麦芽糖淀粉酶基因Gs-MAase(19.0 U/mL)和中性蛋白酶基因Banpr(17000 U/mL)的高效分泌表达。通过敲除K11菌株的内源蛋白酶基因Banpr,碱性蛋白酶BcaprE和生麦芽糖淀粉酶MAase在蛋白酶缺陷型突变株7-6中的表达水平分别提高了 25.0%和19.4%。在15-L发酵罐水平上,碱性蛋白酶重组菌株QC-E分泌BcaprE的水平进一步提高到了 30200 U/mL。为获得不同强度的解淀粉芽孢杆菌分泌表达盒文库,同时也为了探索高效分泌表达元件所介导的高效分泌机制,对高效分泌表达盒PamyQ-SPaprE进行了随机突变研究。通过易错PCR方法构建分泌表达盒随机突变文库,共获得1352个转化子。对这1352个转化子进行活性平板和摇瓶发酵试验,共筛选到20株表达分泌强度较野生型更佳的突变株。该分泌表达盒文库的构建不仅为解淀粉芽孢杆菌表达系统外源蛋白的表达提供更多的平台,也为解淀粉芽孢杆菌高效分泌表达机制的深入研究奠定了基础。以上试验结果充分证明了以解淀粉芽孢杆菌7-6为宿主菌,不同丰度PamyQ-SPaprE为分泌表达盒所建立的解淀粉芽孢杆菌表达体系不仅能够稳定的生产重组蛋白及进行酶蛋白的高密度发酵,而且该表达体系具有较好的通用性,可为更多酶制剂的高效表达提供新的途径。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2018-08-01）
刘欣[3]（2018）在《枯草芽孢杆菌ATCC6051宿主构建及表达元件、蛋白折迭功能基因的研究》一文中研究指出枯草芽孢杆菌表达系统具有生物安全性高、遗传背景清晰、蛋白分泌能力强等突出特点,广泛地应用于生产和表达各种外源蛋白。本研究旨在利用无痕敲除技术和胞外蛋白谱构建无抗性标记的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达宿主、采用转录组学技术和信号肽库筛选挖掘最优表达元件以及分析Sec分泌途径中折迭相关基因功能的研究,建立具有应用潜力的枯草芽孢杆菌高效表达系统。本文先通过温敏型质粒pKS2无痕敲除体系失活了B.subtilis ATCC 6051的八种蛋白酶编码基因(nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wprA),一个芽孢形成因子F编码基因spollAC和surfactin合成酶编码基因srfAC,成功构建了B.subtilis无抗性标记、不产孢子且副产物少的宿主;并以B.subtilis 168为参照做相对应的研究。将茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)来源的转谷氨酰胺酶酶原(proMTG)和嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)来源的耐热半乳糖苷酶(BgaB)验证表达宿主的重组蛋白可行性,菌株B.subtilis ATCC6051?10(?spollAC、?srfAC、?aprE、?nprE、?nprB、?epr、?mpr、?bpr、?vpr、?wprA)对proMTG和BgaB的重组表达效果最好;且建立了该宿主的胞外分泌蛋白谱图。基于对数生长后期的叁株模式芽孢杆菌(B.subtilis 168、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC14580、巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium DSM319)的RNA-Seq数据分析,以BgaB为报告蛋白构建了启动子筛选质粒,先将叁株芽孢杆菌中高表达的前十个基因的启动子片段供筛选,获得了31个启动子侯选库;其中两个启动子(P_(glvA)和P_(hag))在对数生长后期BgaB酶活高于传统强启动子P43。将叁株芽孢杆菌表达基因通过同源基因家族分析(Orthomcl)和RPKM值排名关系数值,将前十个共同高表达同源基因的启动子片段供筛选,得到30个启动子侯选库;筛选得到五个启动子的BgaB酶活高于P43,其中启动子P_(ydzA)(B.subtilis 168)酶活最高为44.3 U/mL,是P43的3.41倍。将上述七个强启动子表达proMTG和来自长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶(PUL),结果表明启动子P_(sodA)(B.naganoensis DSM319)表达proMTG酶活最高为82.6 U/mL,是P43的1.49倍,启动子P_(spoVG)(B.Subtilis 168)表达PUL酶活最高为328.4 U/mL,是P43的1.47倍。将173种Sec信号肽库构建信号肽高通量筛选载体,以BgaB为目标蛋白进行筛选,共得到了48种有效分泌的信号肽,其中细胞分离酶LytF信号肽的分泌效果最显着。将信号肽库进一步用于proMTG和来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的麦芽糖型淀粉酶AmyM的信号肽筛选研究,proMTG获得30种有效分泌的信号肽,AmyM获得27种有效分泌的信号肽,都是在AprE的引导分泌效果最好。结果证实了信号肽对不同蛋白的分泌效率有着明显的差异,需对目标蛋白进行特异性筛选。将前期筛选的最佳表达宿主6051?10、最强启动子P_(sodA)和最优分泌信号肽S_(aprE)重组表达proMTG,重组菌M5-1在摇瓶培养48 h达到酶活最高值126.55 U/mL;经亲和层析纯化后的酶活为53.06 U/mg,比同期研究报道酶活高1.74倍。5 L发酵罐中进行培养,54 h得到最高酶活855.54 U/mL,是摇瓶的6.76倍;经亲和层析纯化后的酶活为171.98U/mg,是摇瓶的3.24倍。结果表明该表达系统成功实现了proMTG的高效重组分泌表达,具有较好的应用潜力。以6051?10为出发株,构建了四株Sec分泌途径中折迭相关的prsA、htrA、htrB基因缺失的工程菌和叁株整合不同芽孢杆菌的PrsA蛋白的基因工程菌株。应用于重组表达proMTG,结果表明失活prsA的工程菌的酶活最低,只有重组菌M5-1的12.5%,整合及共表达PrsA蛋白均在一定程度上改善了失活自身PrsA蛋白的B.subtilis对proMTG的重组分泌表达。以6051?10为宿主,构建了叁株共表达不同芽孢杆菌的PrsA蛋白和proMTG的重组菌,结果表明过表达PrsA均促进了proMTG的分泌,其中来自B.megaterium的PrsA蛋白迭加效果最好。(本文来源于《华南理工大学》期刊2018-07-09）
马樱芳[4]（2016）在《基于ARTP诱变、表达元件定向改造及发酵优化提高枯草芽孢杆菌生产重组碱性淀粉酶的水平》一文中研究指出碱性淀粉酶是重要的工业酶制剂之一,能够在碱性环境中维持稳定并保持高效的催化活性,广泛应用于纺织、造纸及洗涤剂配方等多个工业领域,具有广阔的市场前景。目前,碱性淀粉酶的生产主要集中于野生型嗜碱微生物的筛选、高产突变株的诱变筛选及酶的异源表达等方面。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是遗传背景较为清晰的革兰氏阳性菌株,具有较强的蛋白分泌能力、易于培养等多种优点,是工业酶制剂理想的表达宿主之一。本研究通过对生产碱性淀粉酶的重组B.subtilis菌株进行常压室温等离子体(ARTP)诱变及筛选,对高产突变株进行发酵优化以提高其产量。在此基础上,进一步筛选并定向改造适合碱性淀粉酶分泌表达的B.subtilis信号肽和启动子。本研究的主要内容如下:(1)基于ARTP诱变和高通量筛选技术,采用先诱变构建突变宿主文库后转化重组质粒构建重组突变库的方式,以B.subtilis WB600为出发菌株,获得一株可用于高效表达碱性淀粉酶的突变体B.subtilis WB600M,其碱性淀粉酶酶活提高了35.0%,且具有较好的遗传稳定性。(2)通过比较与分析,最终确定宿主B.subtilis 168更适合表达重组碱性淀粉酶。以含有碱性淀粉酶重组质粒的B.subtilis 168为出发菌株,通过直接诱变筛选的方式,快速获得一株突变株B.subtilis 168 mut-16#,其产量较出发株提高31.4%且遗传稳定。(3)采用单因素迭加法和正交试验对突变株B.subtilis 168 mut-16#的培养条件及培养基进行了优化。优化后,碱性淀粉酶酶活力达369.3 U·m L-1,是优化前的128.8%。在3 L发酵罐水平,对搅拌转速、培养基浓度及补料组分和方式分别进行优化,最高酶活力达591.5 U·m L-1,相应最适发酵条件:550 r·min-1、2倍碳氮源浓度、发酵10 h时间歇补加终浓度为2.0%的液化淀粉。(4)筛选确定最适产碱性淀粉酶的信号肽为YwbN(M1)。删除信号肽M1后一段长57 bp的假定蛋白序列后,碱性淀粉酶酶活力达538.1 U·m L-1,提高为删除前的1.5倍。对改造后的信号肽M11,进一步采用定点突变技术增加N端正电荷数目,碱性淀粉酶产量达到624.3 U·m L-1。在此基础上,继续增加H区极性氨基酸数目,将16、17、19位非极性氨基酸I、L、W相应突变为极性氨基酸N、S、S,降低信号肽H区疏水性后,碱性淀粉酶产量显着提高,达到983.8 U·m L-1。(5)比较了启动子PHpa II、启动子P43、启动子串联PHpaII-PHpa II、P43-PHpaII对碱性淀粉酶表达的影响,确定启动子PHpa II更适合amyK基因的表达。进一步对启动子PHpaII的-10区和-35区间隔序列长度进行定向改造,删除启动子-27位碱基T、-31位碱基A后,碱性淀粉酶产量较突变前分别提高了23.3%和15.0%,达到1213.1 U·m L-1和1131.2U·m L-1。采用半定量RT-PCR技术验证了突变后酶活力提高的原因。基于前期优化的发酵条件,突变株B.subtilis PM2的碱性淀粉酶产量可达1361.0 U·mL-1。(本文来源于《江南大学》期刊2016-06-01）
刘秀霞,赵子豪,孙杨,杨艳坤,白仲虎[5]（2016）在《谷氨酸棒杆菌内源表达元件的筛选》一文中研究指出【目的】构建谷氨酸棒杆菌表达元件探测载体,筛选能够启动蛋白表达的序列片段。【方法】基于谷氨酸棒杆菌表达载体p XMJ19,利用Golden Gate新型克隆方法构建表达元件插入位点,使筛选的片段能够与报告基因快速无缝衔接,同时避免残留额外的序列对表达元件效果测试产生可能存在的干扰。对本课题组前期的谷氨酸棒杆菌BZH001高、中、低溶氧条件下的发酵样品转录组数据进行分析,筛选出稳定于高转录水平的6个基因,通过软件预测每个基因的启动子区域和5′UTR区域,两者构成能够启动基因表达的功能性元件,并将其从基因组中克隆出来。以增强型绿色荧光蛋白基因egfp作为报告基因,快速测量出表达元件的效果。【结果】获得5个不同效果的内源性表达元件,最好的元件插入探测载体后在谷氨酸棒杆菌中表达的荧光强度大于3 500 RFU/OD600。【结论】通过结合转录组数据,探测载体能够快速有效筛选表达元件,为将来人们对谷氨酸棒杆菌基因工程改造和生物系统的构建提供更多基础材料。(本文来源于《微生物学通报》期刊2016年08期）
廖瑜玲[6]（2016）在《解淀粉芽孢杆菌转录组学及其表达元件的挖掘与应用》一文中研究指出解淀粉芽孢杆菌是一类重要工业微生物,是多种工业酶如α-淀粉酶、果聚糖蔗糖酶、纤溶酶等生产菌株,也是嘌呤核苷、核黄素等初级代谢产物的工业生产宿主。虽然解淀粉芽孢杆菌全基因组测序早已完成,但是解淀粉芽孢杆菌的转录学一直未得到深入的研究。本研究采用RNA-Seq技术对解淀粉芽孢杆菌XH7转录组进行研究,得到解淀粉芽孢杆菌全基因组水平的转录图谱。提取在LB-rich培养基中培养至对数生长后期的解淀粉芽孢杆菌的RNA样品进行RNA-Seq测序,测序结果显示解淀粉芽孢杆菌4204个基因中共有3936个基因发生转录表达(93.6%),确定了1064个转录起始位点和749个操纵子结构。基于转录组和基因组数据了解了解淀粉芽孢杆菌XH7积累鸟苷的原因是嘌呤从头合成代谢途径中重要中间产物IMP倾向鸟苷的合成,并指出提高嘌呤操纵子的转录水平将有利于解淀粉芽孢杆菌XH7中鸟苷产量的进一步提高。基于RNA-Seq数据,高通量挖掘解淀粉芽孢杆菌新的表达元件。以整合在解淀粉芽孢杆菌XH7基因组的P43-bgaB为对照,根据RPKM值判定解淀粉芽孢杆菌XH7基因组中有288个基因表达强于插入的报告基因bgaB。选择其中表达量最高的8个基因,扩增其启动子区域构建β-半乳糖苷酶的表达质粒,筛选得到P_(r2)启动子(编码sigW基因)在对数生长后期β-半乳糖苷酶酶活最高(5300 M u/mL),并成功运用于木聚糖酶基因(xyn)的高效表达,为芽孢杆菌属表达提供了一个σ~W型的强启动子。另外以bgaB作为报告基因,构建了启动子探针载体pBE-bgaB,筛选获得了265个含有解淀粉芽孢杆菌启动子活性片段的重组克隆子库。经过β-半乳糖苷酶酶活的筛选,启动子P41片段的酶活在解淀粉芽孢杆菌中最高达到3017 Miller U/mL。经过RBS Calculator v1.1优化P41启动子的RBS位点,优化后的编号为“382”的RBS位点构建的pBEP41-bgaB(382)质粒β-半乳糖苷酶酶活最高达到6260 Miller U/mL,是未优化的启动子活力的1.9倍,为芽孢杆菌属基因工程改造提供了一个有价值的表达元件。将以上筛选得到的不同强度的启动子P_(r2)和P41运用于鸟苷基因改造工程中,构建了一系列嘌呤启动子替换菌株,以解除嘌呤启动子的转录阻遏作用,提高嘌呤操纵子转录水平。构建一系列截短嘌呤启动子的工程株以解除嘌呤启动子的转录衰减作用。通过摇瓶发酵考察工程菌株的鸟苷合成能力,替换P41启动子工程菌purE:P41的产量最高达16.25 g/L,比出发菌株(WT)提高了22.5%,而替换了P_(r2)启动子工程菌purE:P_(r2)生长受到影响导致产量大大降低,比WT菌株降低了65.78%。通过胞内物质的检测发现工程菌purE::P41胞内IMP含量高于出发菌株。提取工程菌在发酵过程中不同时间点(12 h、24 h、36 h和48 h)的RNA样品,分析嘌呤操纵子的转录情况,得到工程菌purE:P41的嘌呤操纵子的转录得到加强,有利于鸟苷的合成。在嘌呤启动子改造的工程菌purE:P41基础上对其呼吸链进行改造,考察菌体能量利用对鸟苷合成的影响。构建了一系列△cyd工程菌,通过摇瓶发酵考察发现△cyd工程菌的鸟苷含量均有提高,其中purE::P41△cyd工程菌鸟苷产量最高达19 g/L,比WT提高了35.3%。通过胞内有机酸的测定发现△cyd工程菌丙酮酸含量较低,说明代谢途径进入EMP途径减少,增加了PP途径的代谢通量。△cyd工程菌中主要副产物乙酸含量减少,促进了菌体的生长。综合增强嘌呤操纵子的转录并改造其呼吸链的两步的基因工程改造提高了解淀粉芽孢杆菌XH7的鸟苷合成能力。(本文来源于《华南理工大学》期刊2016-01-04）
李国攀,熊萍萍,荣俊[7]（2015）在《多杀性巴氏杆菌外源基因表达元件的构建及其序列分析》一文中研究指出为了在多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)中高效表达外源基因,克隆了天冬酰氨合成酶A(asn A)基因的启动子Pasn A和终止子Tasn A,双酶切获取p UC18质粒的多克隆位点,将这3个片段组装成一个可以方便插入外源基因的表达元件。测序结果分析表明,Pasn A是巴氏杆菌asn A基因的强启动子,具有原核生物典型的Pribnow盒和SD序列。p UC18的多克隆位点mcs具有多个核酸限制性内切酶的单一切点,便于外源基因的插入。Tasn A是巴氏杆菌asn A基因的强终止子,具有很好的回文结构,在发卡结构后面有一段富含A/T区。3个片段表达元件(Pcms T)的构建为完整的巴氏杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒的构建奠定了基础。(本文来源于《湖北农业科学》期刊2015年19期）
杨郁文,张保龙,陈天子,高媛媛[8]（2012）在《棉花PGHNBS启动子维管束特异表达元件的分离及功能研究》一文中研究指出PGHNBS是来源于陆地棉的一个CC-NBS-LRR类基因GHNBS的启动子,该启动子具有维管束特异表达特征。为了分离PGHNBS启动子的调控元件,对该启动子进行了缺失分析。将PGHNBS启动子6个部分缺失片段分别与GUS基因融合构建植物表达载体,这6个表达载体分别为PGN15(-1 420 bp～-28 bp)、PGN27(-1 300 bp～-28 bp)、PGN31(-1 071 bp～-28 bp)、PGN44(-959 bp～-28 bp)、PGN53(-807 bp～-28 bp)和PGN996(-604 bp～-28 bp)。用植物表达载体转化拟南芥,通过对转基因植物的GUS组织化学染色,进一步确认了韧皮部特异表达元件位于-1 071 bp～-959 bp区域。用PLACE进行相似性比较,发现该区域含有脱落酸(ABA)诱导元件、铜离子响应元件以及多个与抗逆相关的MYB转录因子的识别位点。另外,在-1 559 bp～-1 420 bp区域中存在增强子元件。(本文来源于《江苏农业学报》期刊2012年06期）
梁书利[9]（2012）在《基于RNA-Seq技术的毕赤酵母转录组学研究及其表达元件的挖掘》一文中研究指出毕赤酵母表达系统是通用的、高效的外源蛋白表达系统，广泛地应用于生产工业及药用蛋白、研究蛋白分泌和表达机理、分析过氧化物酶体的合成。随着DNA芯片和mRNA测序技术的兴起，转录组学成为揭示蛋白表达调控的重要手段。然而，由于缺少基因组信息及可用的特异性芯片，毕赤酵母转录组一直未得到深入的研究。转录组学研究能够揭示外源蛋白表达时毕赤酵母的调控机制，有助于探讨外源蛋白表达机理，为提高外源蛋白的表达提供重要的理论指导。此外，利用转录组学数据还能挖掘可用的表达元件。基于此，本研究采用RNA-Seq技术对毕赤酵母转录组进行研究，并从中挖掘新型的表达元件。本研究对毕赤酵母的RNA样品进行RNA-Seq测序，测序得到的序列片段（reads）对毕赤酵母基因组的覆盖度为1200倍，如此高的测序深度为全基因组转录分析和毕赤酵母转录结构鉴定提供了丰富的可靠的基础数据。根据RNA-Seq reads在毕赤酵母基因组及基因上的匹配情况，绘制了毕赤酵母全基因组水平的转录图谱。通过代表基因转录水平的标准化数据RPKM判定毕赤酵母基因组的5313个蛋白编码基因中共有4907个发生转录表达。在基因组范围内分析毕赤酵母基因转录体的结构：确定了914个基因的5’非翻译区（5’UTR）和924个基因的3’非翻译区（3’UTR），并分析了UTR长度分布及其与基因功能的关系；确定了291个毕赤酵母基因的上游开放阅读框（uORF）和15个基因的上游起始密码子（uATG）；发现了27个新转录本和4个新外显子。基于RNA-Seq数据，分析基因转录体的可变剪接（alternative splicing，AS）。结果表明，总共在254个毕赤酵母基因中确定了270个可变剪接事件，具有可变剪接的基因占毕赤酵母基因总数的11.91%。通过发生内含子保留（retained intron，RI）的基因数目和发生外显子剪接（cassette exon，CE）的基因数目的比例以及RI和CE的长度关系，推测ID（introndefinition）机制是毕赤酵母基因可变剪接中识别剪接位点的主要机制。通过比较甘油和甲醇条件下毕赤酵母各基因的RPKM值对其表达谱进行差异表达分析。与甘油条件相比，甲醇条件下共1885个基因的表达量具有显着性差异（padj <0.01），其中940个基因表达量上调，945个基因表达量下调。GO分析和KEGG代谢途径分析表明，上调基因主要与蛋白酶体、自体吞噬、N-糖基化合成、甲烷代谢、内质网中蛋白质加工及蛋白转运相关，而不饱和脂肪酸和TCA循环相关基因表达下调。上述结果揭示了碳源由甘油转换成甲醇后重组毕赤酵母的代谢特征。结合RNA-Seq测序所得到的数据，对毕赤酵母表达元件进行挖掘。3个内源信号肽得到鉴定，其分泌能力强于α-factor。2个UTR序列中存在IRES元件，为构建多拷贝提供可行的元件。此外，根据差异表达分析鉴定了3个诱导型启动子。(本文来源于《华南理工大学》期刊2012-12-10）
吕娟[10]（2010）在《枯草芽孢杆菌lipA基因表达元件的修饰》一文中研究指出在微生物的基因工程育种中,使用强启动子和稳定子表达目的基因,可以获得高水平的表达效果。本文选择噬菌体Φ29的A1启动子和枯草芽孢杆菌aprE基因的稳定子,构成一个新的表达盒,用于在枯草芽孢杆菌DB104染色体上替换lipA基因原有的表达元件。本文主要对lipA基因表达元件原位修饰的基因操作方法进行了研究。采用重迭PCR方法,将两个lipA基因同源片段和红霉素抗性基因片段拼接,得到重组片段LE;LE与质粒pEASY-T1载体连接,在大肠杆菌中构建了重组质粒pT1-LE;转化枯草芽孢杆菌DB104,筛选得到了具有红霉素抗性的lipA基因缺陷菌株DB104E。构建了带有野生型lipA基因片段的重组质粒pT1-LA,用于转化DB104E,可以恢复lipA基因的缺陷;并发现lipA~+菌株可以在橄榄油基本培养基上生长,而lipA-菌株则不能生长,橄榄油基本培养基能够用于筛选lipA~+的转化子。通过重迭PCR方法,将A1启动子序列、aprE稳定子序列和上下游lipA基因同源序列拼接,得到了重组片段LPAS,与质粒pEASY-T1 Simple连接,在大肠杆菌中构建了重组质粒pT1-PAs;通过对质粒pT1-PAs的测序,证明A1启动子序列和aprE稳定子序列按照预定设计拼接成一个表达盒;但质粒pT1-PAs转化DB104E,在橄榄油基本培养基上不能筛选出转化子,推测原因可能是表达盒没有功能,或者转化方法存在问题。为了证明在pT1-PAs转化过程中基因重组确实发生,采用酶切连接的方法,将氯霉素抗性基因插入到pT1-PAs中Α1启动子与上游同源片段之间的EcoRI位点上;连接产物转化大肠杆菌,检测了将近70个菌落,结果都是假阳性菌,没有得到转化子的原因是重组质粒缺少筛选标记且连接体系不合适。另外,因为特定序列限制了PCR引物的设计,将上下游同源序列、氯霉素抗性基因序列和表达盒序列拼接为重组片段的重迭PCR也没有成功。但是,根据本研究所获得的经验,用这种方法在染色体原位修饰lipA基因的表达元件是可行的。(本文来源于《天津大学》期刊2010-06-01）
表达元件论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是多种重要饲用酶制剂的生产菌株,因其具有较强的蛋白分泌能力,其在作为高效表达宿主菌方面具有巨大的发展潜力及应用前景。然而,解淀粉芽孢杆菌中存在的限制修饰系统、质粒稳定性差、表达元件缺乏以及内源蛋白酶活力高等问题严重限制了其在基因工程研究中的广泛应用。本研究的核心材料解淀粉芽孢杆菌K11(B.amyloliquefaciens K11)是一株高产中性蛋白酶和角蛋白酶的菌株。前期通过转化条件的摸索和质粒结构元件的优化,已较好的解决了 K11菌株遗传和质粒稳定性差的难题,为将K11菌株开发成为高效的异源蛋白表达宿主奠定了坚实的基础。本研究以解淀粉芽孢杆菌K1 1为宿主菌、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BcaprE作为报告基因,通过高产酶蛋白的工业菌株的强启动子(PamyQ、PaprE、Pnpr)和高效分泌信号肽(SPamyQ、SPaprE、SPnpr)的优化组合,筛选适用于K11菌株高效分泌表达外源蛋白的通用表达元件。摇瓶测试结果显示:在以α-淀粉酶基因启动子PamyQ、碱性蛋白酶基因信号肽SPaprE组成的表达元件调控下,碱性蛋白酶基因BcaprE在解淀粉芽孢杆菌K11中的胞外分泌表达水平为最高,可达13804U/mL。该优化组合元件PamyQ-SPaprE,同样也能够有效的引导生麦芽糖淀粉酶基因Gs-MAase(19.0 U/mL)和中性蛋白酶基因Banpr(17000 U/mL)的高效分泌表达。通过敲除K11菌株的内源蛋白酶基因Banpr,碱性蛋白酶BcaprE和生麦芽糖淀粉酶MAase在蛋白酶缺陷型突变株7-6中的表达水平分别提高了 25.0%和19.4%。在15-L发酵罐水平上,碱性蛋白酶重组菌株QC-E分泌BcaprE的水平进一步提高到了 30200 U/mL。为获得不同强度的解淀粉芽孢杆菌分泌表达盒文库,同时也为了探索高效分泌表达元件所介导的高效分泌机制,对高效分泌表达盒PamyQ-SPaprE进行了随机突变研究。通过易错PCR方法构建分泌表达盒随机突变文库,共获得1352个转化子。对这1352个转化子进行活性平板和摇瓶发酵试验,共筛选到20株表达分泌强度较野生型更佳的突变株。该分泌表达盒文库的构建不仅为解淀粉芽孢杆菌表达系统外源蛋白的表达提供更多的平台,也为解淀粉芽孢杆菌高效分泌表达机制的深入研究奠定了基础。以上试验结果充分证明了以解淀粉芽孢杆菌7-6为宿主菌,不同丰度PamyQ-SPaprE为分泌表达盒所建立的解淀粉芽孢杆菌表达体系不仅能够稳定的生产重组蛋白及进行酶蛋白的高密度发酵,而且该表达体系具有较好的通用性,可为更多酶制剂的高效表达提供新的途径。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
表达元件论文参考文献
[1].饶忆,师璐,王豪,熊世颉,蔡冬波.通过优化表达元件及培养基组分提高地衣芽胞杆菌中碱性丝氨酸蛋白酶产量[J].微生物学通报.2019
[2].王慧.解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensK11高效表达体系的建立及其高效表达元件的优化[D].中国农业科学院.2018
[3].刘欣.枯草芽孢杆菌ATCC6051宿主构建及表达元件、蛋白折迭功能基因的研究[D].华南理工大学.2018
[4].马樱芳.基于ARTP诱变、表达元件定向改造及发酵优化提高枯草芽孢杆菌生产重组碱性淀粉酶的水平[D].江南大学.2016
[5].刘秀霞,赵子豪,孙杨,杨艳坤,白仲虎.谷氨酸棒杆菌内源表达元件的筛选[J].微生物学通报.2016
[6].廖瑜玲.解淀粉芽孢杆菌转录组学及其表达元件的挖掘与应用[D].华南理工大学.2016
[7].李国攀,熊萍萍,荣俊.多杀性巴氏杆菌外源基因表达元件的构建及其序列分析[J].湖北农业科学.2015
[8].杨郁文,张保龙,陈天子,高媛媛.棉花PGHNBS启动子维管束特异表达元件的分离及功能研究[J].江苏农业学报.2012
[9].梁书利.基于RNA-Seq技术的毕赤酵母转录组学研究及其表达元件的挖掘[D].华南理工大学.2012
[10].吕娟.枯草芽孢杆菌lipA基因表达元件的修饰[D].天津大学.2010