论文摘要
目的建立核糖体展示库,利用建立的核糖体展示技术进行筛选SEB抗体的研究。方法本试验第一部分为构建原核表达SEB蛋白的重组质粒。选用了已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选的Invitrogen的pET系统,通过SEB基因片段与N端具有6个组氨酸PET 32a载体相连接,使表达产物N端融合6个组氨酸标签,采用金属离子螯合的亲和层析法,利用HiTrap Chelating Ni柱纯化目标蛋白。提供了核糖体展示筛选所需抗原。本试验第二部分为构建源于小鼠单链可变区基因的核糖体展示库,并利用核糖体展示技术进行筛选SEB抗体的初步研究。通过TRIzol法提取了Balb/c和C57小鼠的总RNA,利用PCR技术扩增小鼠的重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL),扩增和连接了核糖体展示所需要的所有元件,构建了包括T7启动子、茎环、核糖体结合位点、单链抗体基因库、间隔序列的核糖体展示的基因摸板。其后对该文库进行了体外转录和体外翻译,以重组SEB为抗原进行了初步筛选。结果成功构建了能够表达出SEB蛋白的重组质粒,命名为SEB321。以3mmol/LIPTG诱导,30℃振摇4h,可表达出SEB蛋白,进一步利用HiTrap Chelating Ni柱进行了亲和纯化,再以进行了Western blot鉴定。成功构建了源于小鼠单链可变区基因的核糖体展示库,并且测定出最终库容量为7.33×1013。。其后对该文库进行了体外转录和体外翻译,表明其可以有效地进行体外转录翻译。利用核糖体展示技术以重组SEB蛋白为抗原进行了初步筛选,获得阳性结果。结论建立了库容量为7.33×1013的源自非免疫小鼠脾脏的单链抗体可变区基因片段的核糖体展示库。摸索了建库条件,并且利用商业载体PET 32a为原核表达载体成功表达出重组SEB蛋白,以重组SEB蛋白为抗原,进行了初步筛选,筛选SEB抗体结果为阳性。证明了源自非免疫小鼠脾脏的单链抗体可变区基因片段的核糖体展示库能够快速有效筛选抗体,为本课题组以后利用核糖体展示进行其它抗体的筛选奠定基础,也为相关核糖体展示技术的研究提供了借鉴。
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- [1].核糖体展示技术原理与应用[J]. 解放军预防医学杂志 2008(03)
- [2].核糖体展示技术的研究与应用现状[J]. 现代生物医学进展 2009(19)
- [3].核糖体展示技术在非编码核酸研究中的应用[J]. 生命科学 2014(03)
- [4].利用核糖体展示技术筛选口蹄疫病毒单链抗体基因[J]. 中国生物工程杂志 2012(07)
- [5].核糖体展示技术筛选Nogo-66拮抗性小分子多肽[J]. 中国病理生理杂志 2010(10)
- [6].核糖体展示技术的研究进展[J]. 江西农业学报 2009(09)
- [7].核糖体展示多肽技术的原理和应用[J]. 中华肿瘤防治杂志 2010(22)
- [8].应用核糖体展示技术筛选制备抗TNF-α人源抗体的研究[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2009(02)
- [9].体外展示技术及其在抗体工程中的应用[J]. 现代生物医学进展 2009(13)
- [10].核糖体展示研究进展[J]. 生物技术通报 2016(08)
- [11].人源性胃癌单链抗体库的构建[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2009(08)
- [12].单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J]. 免疫学杂志 2011(02)
- [13].Nogo-66拮抗性多肽的筛选及其对脊髓损伤大鼠轴突再生的影响[J]. 神经解剖学杂志 2010(01)