半滑舌鳎（Cynoglossus Semilaevis）雌性特异Fosmid片段的筛选与FISH定位

论文摘要

半滑舌鳎（Cynoglossus? semilaevis）是我国传统经济鱼类,因其肉质鲜美营养丰富而深受喜爱。目前半滑舌鳎已实现工厂化养殖,但对其基因组及性染色体的研究依然较少。本研究通过对已建成的fosmid文库进行有序混合,构建了fosmid文库的两步-三维-PCR筛选系统。同时通过筛选半滑舌鳎W染色体文库,找到一对雌鱼特异性引物,使用该引物对fosmid文库进行筛选,获得一个包含该引物序列的阳性克隆,并使用荧光原位杂交技术将该克隆定位到半滑舌鳎W染色体上。主要结果如下:1、半滑舌鳎fosmid文库筛选系统的构建与验证构建fosmid文库的两步-三维-PCR筛选系统,首先要构建fosmid文库的超级池与相应二级池。以每20个96孔板构建一个超级池、8个行池、7个列池及20个板池。每个超级池含有该20个板的所有菌（1920个）。最终得到10个超级池及350个二级池。超级池构建完成后,使用实验室已有的7个半滑舌鳎功能基因引物对超级池及其二级池进行了筛选,筛选结果表明所有基因均能筛到两个以上的阳性克隆并准确定位到fosmid文库中,表明所构建的两步-三维-PCR筛选系统可以满足基因筛选的需要。2、W染色体特异性片段的筛选及FISH定位通过对半滑舌鳎W染色体文库进行测序、引物设计,获得210对引物,使用这些引物分别对半滑舌鳎雌、雄鱼基因组DNA进行PCR筛选,最终得到1对在雌鱼中扩增有条带而雄鱼中扩增无条带的引物,长度为239bp。使用该引物对10雄10雌基因组DNA进行PCR筛选,验证了其W染色体特异性。使用该引物对fosmid文库进行筛选,成功将一个包含该引物序列的阳性克隆定位到fosmid文库中。随后通过荧光原位杂交技术将该克隆定位到半滑舌鳎染色体分裂相上。在所有分裂相中,FISH杂交信号仅出现在W染色体的中部位置,证明了该引物的W染色体特异性。本研究获得的W染色体特异性引物可以通过简单的PCR反应快速鉴别半滑舌鳎生理性别,对于半滑舌鳎的伪雄鉴别及全雌育苗具有极大的推动作用;同时通过fosmid文库筛选获得的W染色体特异性克隆对于后续的W染色体及其基因研究、构建W染色体重叠群contigs等工作具有重要的意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 0 引言
• 1 大片段基因组文库
• 1.1 λ噬菌体文库
• 1.2 Cosmid 文库
• 1.3 Fosmid 文库
• 1.4 YAC 文库
• 1.5 BAC 文库
• 1.6 其他大片段文库
• 2 大片段基因组文库的应用
• 2.1 物理作图
• 2.2 基因组测序
• 2.3 图位克隆
• 2.4 分子标记的发掘
• 2.5 染色体定位
• 3. 文库的筛选系统
• 3.1 Southern 杂交筛选系统
• 3.2 三维PCR 筛选系统
• 4 荧光原位杂交技术（FISH）及其研究进展
• 4.1 荧光原位杂交技术的原理
• 4.1.1 荧光原位杂交的探针标记方法
• 4.1.2 荧光原位杂交的探针具体标记方式
• 4.1.3 荧光原位杂交的探针类型
• 4.1.4 靶染色体类型
• 4.2 荧光原位杂交技术的发展
• 4.2.1 基因组原位杂交（genomic in situ hybridization GISH）
• 4.2.2 多色FISH （M-FISH）
• 4.2.3 BAC-FISH
• 4.2.4 Fiber-FISH
• 4.2.5 染色体分带-FISH 技术
• 4.3 荧光原位杂交技术在鱼类遗传学中的应用
• 4.3.1 基因定位研究
• 4.3.2 性别鉴定相关研究
• 4.3.3 种间杂交相关研究
• 5. 本研究的目的与意义
• 第二章 Fosmid 文库筛选系统的构建及检验
• 引言
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 缓冲液
• 1.3 仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 超级池的构建
• 1.4.2 超级池DNA 的提取
• 1.4.3 功能基因的筛选
• 2 结果
• 2.1 超级池及相应二级池的构建
• 2.2 功能基因的筛选
• 3. 讨论
• 第三章 半滑舌鳎 W 染色体特异性片段筛选与 FISH 定位
• 引言
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 半滑舌鳎W 染色体特异性引物的筛选
• 1.4.2 W 染色体片段在fosmid 文库中的定位
• 1.4.3 阳性克隆的荧光原位杂交
• 2 结果
• 2.1 半滑舌鳎W 染色体特异性引物的筛选
• 2.2 W 染色体特异性片段的筛选
• 2.3 阳性克隆的荧光原位杂交结果
• 3.讨论
• 3.1 Fosmid 文库筛选与FISH 结合
• 3.2 获得半滑舌鳎W 染色体特异性引物的意义
• 参考文献
• 致谢