脱落酸调控油菜素甾醇初级信号通路的研究

论文摘要

植物激素在共同调节植物生长发育和生理生化过程中发挥重要的作用,但目前对激素互作的分子机制了解甚少。油菜素甾醇（brassinosteroids,BRs）是上世纪70年代发现的第六大植物激素,其在植物的很多发育过程中起着重要作用,包括茎和根中的细胞分裂和伸长、光形态建成、生殖发育、叶片衰老、以及对胁迫的反应等。脱落酸（abscisic acid,ABA）作为另一类作用广泛的植物激素,也调控着植物生长发育的诸多方面,包括参与植物的胚胎发育、种子休眠与萌发、气孔关闭、开花时间和果实成熟等生理过程以及植物对胁迫的适应性反应。已有研究表明,BRs和ABA共同调控数百个基因的表达,从而共同调节很多发育和生理过程。同时,已经发现BR的一些突变体具有对ABA反应改变的表型,两者在发芽率上表现出相互拮抗的生理效应。然而,对于两者互作是否通过修饰或介入到初级信号途径中,抑或通过平行或独立的途径起作用,却仍然未知。本研究工作主要包括:首先利用BR相关的多种遗传材料,系统研究了BRs和ABA两类激素在调节种子发芽率上具有相互拮抗的作用,为研究信号互作奠定生理基础。接着利用分子（DWF4和CPD转录水平）和生化标记（BES1的磷酸化状态）并结合ABA合成缺失突变体,证明外源的ABA能快速抑制BR的信号输出。再者,研究发现BR受体BRI1的强突变体bri1-116中,ABA仍能调节BR的信号输出;且在BKI1-YFP过表达系中,BKI1-YFP的亚细胞定位也不受ABA的影响,已知油菜素内酯（BRs中最具活性的一种形式）能促使BKI1-YFP从膜上解离;而用LiCl处理使下游组分BIN2失活却抑制了ABA对BR信号输出的调节。最后,利用ABA早期信号突变体abi1和abi2,得出ABA调控BR的初级信号转导途径主要依赖于ABA信号组分ABI2,部分依赖于ABI1。因此我们提出了BRs与ABA信号互作的模型,ABA对BR初级信号转导途径的调节界定在受体BRI复合体的下游,BIN2（含BIN2）的上游。这一模型有力的解释了为什么受BR调节的基因有一大部分也受到了ABA的调节,同时为BRs和ABA信号的互作提供了新的分子机制。本研究通过遗传、细胞和分子水平的系统深入研究,确定了ABA影响BR的初级信号输出,且界定了信号互作的区域,同时形成了ABA对BR信号输出影响的初步模型。本研究从分子层面有力的支持了BRs和ABA在生理实验中的拮抗效应,具有重要的理论意义。同时为研究激素互作提供了很好的范例,也为植物更好的适应环境提供理论依据和目标基因。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 植物激素互作的研究进展
• 1.1.1 油菜素甾醇与生长素互作的研究进展
• 1.1.2 油菜素甾醇与其它激素互作的研究进展
• 1.1.3 脱落酸与激素互作的研究进展
• 1.2 油菜素甾醇的研究进展
• 1.2.1 油菜素甾醇的合成、代谢以及生物学功能
• 1.2.2 油菜素甾醇的信号转导途径
• 1.3 脱落酸的研究进展
• 1.3.1 脱落酸的合成、代谢以及生物学功能
• 1.3.2 脱落酸的信号转导途径
• 1.4 油菜素甾醇和脱落酸信号互作的研究进展
• 1.5 技术路线
• 第2章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 载体
• 2.1.4 试剂盒
• 2.1.5 主要化学品
• 2.1.6 酶及其它
• 2.1.7 抗生素
• 2.1.8 抗体
• 2.1.9 图象及数据分析软件
• 2.1.10 主要的仪器设备
• 2.2.方法
• 2.2.1 拟南芥总RNA的提取
• 2.2.2 cDNA第一链的合成
• 2.2.3 RT-PCR扩增拟南芥所需基因cDNA
• 2.2.4 载体构建
• 2.2.5 大肠杆菌转化及质粒提取
• 2.2.6 农杆菌电击转化
• 2.2.7 植物培养,转化以及杂交
• 2.2.8 拟南芥基因组DNA的提取
• 2.2.9 荧光定量PCR
• 2.2.10 蛋白提取
• 2.2.11 免疫分析（Western blot）
• 2.2.12 蛋白体内外互作实验
• 2.2.13 共聚焦显微镜观察蛋白的亚细胞定位
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 结果
• 3.1.1 系统研究BR和ABA生理上的互作关系
• 3.1.2 初步确定BR和ABA信号上的互作关系
• 3.1.3 ABA对BR信号的作用并不依赖于BR的感受
• 3.1.4 ABA对BR信号的作用需要通过BIN2
• 3.1.5 ABA对BR信号的作用需要依赖于ABA早期信号
• 3.1.6 利用酵母双杂交对BR和ABA信号途径的已知组分进行鉴定
• 3.1.7 利用体外GST Pull-down实验对互作组分作进一步验证
• 3.2 讨论
• 3.2.1 ABA抑制了BR的初级信号输出
• 3.2.2 BR和ABA信号途径的互作区域
• 3.2.3 ABA对BR信号输出影响的初步模型
• 3.2.4 BR和ABA信号途径互作的后续研究
• 参考文献
• 附录1 引物序列表
• 附录2 培养基配方
• 附录3 载体图谱
• 附录4 常用试剂配方
• 学术会议（部分列举）
• 其它说明
• 缩略词表
• 致谢
• 论文发表例举