论文摘要
汞及其它重金属传统的检测方法如原子吸收光度法、电感耦合等离子体质谱法等可满足痕量检测需要,但这些方法设备昂贵、检测费时费力且成本高,不适应现场快速检测的需要。免疫检测方法具有快速、灵敏、适于现场检测等特点,为汞及其它重金属的检测提供了一种新的选择。本研究旨在制备高亲和力、高特异性抗重金属汞的单克隆抗体,并以单克隆抗体为基础建立检测汞离子的快速免疫分析方法。选用螯合剂EDTA的衍生物aminobenzyl-EDTA、ITCBE将汞离子螯合,再和载体蛋白偶联,制备汞的免疫抗原、检测抗原及对照检测抗原,采用SDS-PAGE电泳、紫外扫描、原子吸收法及动物免疫方法对所制备的抗原偶联物进行鉴定。用经鉴定免疫原性较好的免疫抗原KLH-aminobenzyl-EDTA-Hg免疫BALB/c小鼠,六免后进行细胞融合、杂交瘤细胞筛选、克隆试验,只保留对BSA-aminobenzyl-EDTA-Hg强阳性、BSA-aminobenzyl-EDTA阴性的细胞株,并进行抗体亚类鉴定。选用分泌抗体亚类为IgG的细胞株进行腹水制备、纯化、鉴定。利用纯化的抗汞单克隆抗体建立用于检测汞离子的间接竞争ELISA方法及胶体金免疫层析法。用aminobenzyl-EDTA、ITCBE成功制备出完全免疫抗原（KLH-aminobenzyl-EDTA-Hg、KLH-ITCBE-Hg）、检测抗原（BSA-aminobenzyl-EDTA-Hg、BSA-ITCBE-Hg）、对照检测抗原（BSA-aminobenzyl-EDTA、BSA-ITCBE）,免疫抗原KLH-aminobenzyl-EDTA-Hg比KLH-ITCBE-Hg更易刺激小鼠产生特异性抗体。用免疫原性较好的KLH-aminobenzyl-EDTA-Hg免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、筛选试验,成功制备出2株抗汞单克隆抗体,其中3D9亚类为IgM,5F7为IgG1；用细胞株5F7进行腹水大量生产获得的腹水效价为1.28×106,亲和常数Ka为4.31×109L/mol,与Cd2-、Pb2+的交叉反应率分别为0.94%、0.381%.与其它金属离子的交叉反应率<小于0.2%,属于高效价、高亲和性、高特异性抗体。利用抗汞单克隆抗体（5F7）建立了检测汞离子的间接竞争ELISA方法,该法与Cd2+Pb2+的交叉反应率分虽为0.97%、0.493%,与其它金属离子的交叉反应率<0.2%,最低检测限为0.042μg/L,检测范围为0.087-790.4μg/L,批内平均变异系数（CV）为4.36%,批间变异系数为6.29%；汞离子标准溶液添加回收率为96.47-104.6%；用于实际环境水样检测与石墨炉原子吸收法相比,符合率为88.82-104.64%。用单克隆抗体（5F7）成功制备出用于检测汞离子的免疫胶体金试纸条,该试纸条与水样中常见的离子标准溶液（Cu2+,Zn2+, Cd2+,Cr3+, Pb2-, Co2-, Ni2-,Mg2-,Ag-, Ca2-, Mr2-, Mg2-, Fe3-,浓度范围0.0001-100μg/mL）不发生交义反应,表明试纸条特异性强；当汞离子浓度为0.1、0.5μg/L时,试纸条呈阴性,当汞离子浓度＞0.8μg/L时试纸条呈阳性,表明所制备的试纸条检测限为0.8μg/L；4℃保存3个月后,所有试纸条检测限均为0.8μg/L,表明试纸条稳定性及重复性较好。
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标签：抗原论文; 单克隆抗体论文; 间接竞争论文; 胶体金免疫层析试纸条论文;