N-糖酰胺酶F的性质及脱糖基化作用的研究

论文摘要

N-糖酰胺酶F（Peptide-N4-（N-acetyl-β-D-glucosaminyl）asparigine amidase; PNGase F; EC 3.5.1.52）能够在温和的条件下从糖肽、糖蛋白上面完整切下N-连接的寡糖链（N-糖苷）,将寡糖链和蛋白部分分开。糖酰胺酶F具有广泛的底物专一性,对所有类型的N-寡糖链都有作用。这些特性使糖酰胺酶F在糖链结构分析、糖链在生物体内的作用和糖链对糖蛋白的作用的研究中起到了重要的作用。现在商业化的N-糖酰胺酶F主要从脑膜炎脓杆菌（Flavobacterium meningosepticum）中提取。提取和纯化N-糖酰胺酶F是一个十分耗费和耗时的工作,因此市场价格十分昂贵,这大大限制了N-糖酰胺酶的广泛利用和N-糖链大规模制备。 为了获得大量廉价的N-糖酰胺酶F,本论文研究的主要内容为根据目的基因N-糖酰胺酶F的cDNA序列设计引物,以F.meningosepticum菌株的基因组为模板,进行PCR扩增反应;将所得的DNA片段经双酶切后与载体pYD1质粒进行连接,然后导入大肠杆菌DH5α,用Ampr筛选阳性克隆并用双酶切和PCR鉴定重组质粒pYD1/PNGase F。转化酿酒酵母EBY100 （Saccharomyces cerevisiae）,N-糖酰胺酶F将通过酵母菌的分泌系统和Aga1-Aga2融合蛋白自动连接到酵母菌细胞壁上,实现N-糖酰胺酶F的表达—纯化—固定一步化。通过免疫荧光试验证明N-糖酰胺酶F已经成功的锚定在EBY100酵母细胞表面。经流式细胞仪（FACS）检测,N-糖酰胺酶F细胞表面锚定率最大达到47%。通过摸索培养和诱导条件的优化试验,发现首先在包含2%葡萄糖的YNB-CAA（0.67%YNB; 0.5%Casamino acids）培养基中培养,当菌体浓度达到OD600=2.2时,转接到含有2%半乳糖的YNB-CAA培养基中,使OD600=0.8;20℃诱导培养36h离心收集菌体,每升发酵液可获得13g锚定有N-糖酰胺酶F的菌体。以糖蛋白RNase B、IgG、人转铁蛋白为酶反应底物对表面锚定有N-糖酰胺酶F酵母细胞进行酶活专一性试验,证明该固定化酶对三种类型的糖蛋白都有作用。以糖蛋白RNase B为酶反应底物对该固定化酶的最优温度、pH、诱导条件进行测定,确定最优酶反应条件为pH5.5,温度为37℃,最佳诱导条件36h。 为了得到可溶性的N-糖酰胺酶F,将N-糖酰胺酶F基因重组到pET28a载体上,在大肠杆菌中进行诱导表达,表达量在30%以上。经SDS-PAGE电泳检测,在34kD有一条目的带。经Ni-NAT纯化,纯度达到90%以上。 实验结果表明我们已经获得了锚定有N-糖酰胺酶F的酵母细胞,该固定化的N-糖酰胺酶F纯化步骤简便,可重复利用,极大的降低了该酶的生产成本。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1. 糖生物学研究意义
• 1.1 寡糖链的重要作用
• 1.1.1 寡糖链是许多糖缀合物发挥生物功能所必需的
• 1.1.2 糖缀合物通过寡糖链的识别作用决定着细胞的识别、集聚及受体作用
• 1.1.3 寡糖链的识别作用决定着糖缀合物的组装、转运、消化失活及分类储藏等
• 1.1.4 病原细菌在哺乳动物组织细胞靶位上的黏附是感染的关键步骤，大多数微生物在细胞表面的黏附是由糖链介导的
• 1.2 寡糖链对糖蛋白的作用
• 1.2.1 蛋白的糖基化影响蛋白质合成时的正确折叠及细胞内定位
• 1.2.2 蛋白的糖基化大大增强了蛋白质的体外、体内的稳定性
• 1.2.3 糖链在新生肽链折叠过程中的作用
• 1.2.4 糖链对糖蛋白水溶性的影响
• 1.3 糖蛋白的结构
• 1.3.1 N-连接糖肽
• 1.3.2 O-连接糖肽
• 1.4 糖蛋白的合成
• 1.4.1 N-糖蛋白的合成
• 1.4.2 O-糖蛋白的合成
• 1.5 糖蛋白的降解
• 2. N-糖酰胺酶F研究及应用
• 2.1 N-糖酰胺酶研究现状
• 2.2 N-糖酰胺酶F的来源、分子结构、功能及其催化的分子机制
• 2.3 真核细胞中的N-糖酰胺酶
• 2.4 N-糖酰胺酶:PNGase F与PNG1的比较
• 3. 细胞表面表达系统
• 3.1 酵母细胞表面表达系统介绍
• 3.2 酵母表面展示系统优点
• 3.3 酵母细胞壁结构
• 3.4 酿酒酵母的表面表达原理
• 3.5 酵母表面展示系统的类型
• 3.5.1 α凝集素表面展示系统
• 3.5.2 a凝集素目的蛋白表面展示系统
• 3.6 a凝集素目的蛋白表面展示系统研究进展
• 3.7 表面展示系统应用
• 3.7.1 固定化酶
• 3.7.2 对抗体亲和力进行改造
• 3.7.3 生产口服疫苗
• 3.7.4 蛋白的定向进化
• 4. 本论文的研究目的和意义
• 4.1 意义
• 4.2 现状与问题
• 4.3 实验目的
• 实验部分
• 1. 试验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 分子克隆用酶和试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 溶液
• 1.5 引物
• 2. 实验方法
• 2.1 N-糖酰胺酶F基因在酿酒酵母表面的表达
• 2.1.1 菌株的活化培养
• 2.1.2 脑膜炎脓杆菌基因组的提取
• 2.1.3 引物合成和目的基因N-糖酰胺酶F的PCR扩增
• 2.1.4 pYD1质粒的SDS碱裂解法制备
• 2.1.5 目的基因片段的回收
• 2.1.6 目的基因与载体的限制性内切酶消化反应
• 2.1.7 目的基因与载体的连接反应
• 2.1.8 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.9 连接产物的大肠杆菌转化
• 2.1.10 重组质粒的制备
• 2.1.11 重组质粒的双酶切验证
• 2.1.12 酵母细胞感受态制备、转化
• 2.1.13 酵母中质粒DNA的提取
• 2.1.14 重组蛋白的诱导表达
• 2.2 免疫荧光分析
• 2.3 流式细胞仪分析N-糖酰胺酶F细胞表面锚定情况
• 2.4 N-糖酰胺酶F基因在大肠杆菌中的表达
• 2.4.1 引物合成和目的基因N-糖酰胺酶的PCR扩增
• 2.4.2 pET28a质粒的SDS碱裂解法制备
• 2.4.3 目的基因与载体的限制性内切酶消化反应
• 2.4.4 目的基因与载体的连接反应
• 2.4.5 连接产物的大肠杆菌转化
• 2.4.6 重组质粒的制备
• 2.4.7 重组质粒的双酶切验证
• 2.4.8 重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）
• 2.4.9 N-糖酰胺酶F在大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达
• 2.4.10 目的蛋白的大量制备
• 2.4.11 包含体的处理
• 2.4.12 亲和层析纯化N-糖酰胺酶F
• 2.5 N-糖酰胺酶F脱糖基化作用测定
• 2.5.1 SDS-PAGE测定糖蛋白的脱糖基化
• 2.5.2 用HPLC分析核糖核酸酶B的脱糖基化
• 3. 结果与讨论
• 3.1 N-糖酰胺酶F基因在酿酒酵母表面的表达
• 3.1.1 脑膜炎脓杆菌基因组的提取
• 3.1.2 引物合成和目的基因N-糖酰胺酶F的PCR扩增
• 3.1.3 目的基因载体pYD1
• 3.1.4 表达重组子pYD/PNGaseF的构建
• 3.1.5 酵母中重组质粒提取结果
• 3.2 N-糖酰胺酶F的表面表达情况的疫荧光分析
• 3.3 N-糖酰胺酶F的表面表达情况的流式细胞仪分析
• 3.4 糖酰胺酶F基因在大肠杆菌中的表达
• 3.4.1 pET28a/PNGaseF重组载体的构建
• 3.4.2 N-糖酰胺酶F的诱导表达
• 3.5 N-糖酰胺酶F脱糖基化作用测定
• 3.5.1 SDS-PAGE测定糖蛋白的脱糖基化
• 3.5.2 用HPLC分析核糖核酸酶B的脱糖基化
• 4. 讨论
• 4.1 表达系统的选择
• 4.2 诱导条件的选择
• 4.3 N-糖酰胺酶F脱糖基化作用
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表