高半胱氨酸61(Cyr61/CCN1)及相关分子在胃癌中的表达及其与预后的关系

论文摘要

目的胃癌（Gastric Cancer,GC）是消化道最常见的恶性肿瘤。目前临床上缺乏辅助早期诊断、指导治疗及监测预后的理想分子标志物。寻找有效的分子标志物成为胃癌研究的热点。北京肿瘤分子生物学实验室前期建立了胃癌、癌旁及正常胃黏膜组织的基因表达谱,得到一组正常胃黏膜与胃癌及癌旁组织的差异表达基因。其中高半胱氨酸61细胞外基质蛋白（cysteine-rich 61,Cyr61/CCN1）在胃癌及癌旁组织中均呈高表达,均高于正常胃黏膜组织,且Cyr61在肠型胃癌和弥漫型胃癌中的表达有差异。本研究应用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测Cyr61在人胃癌细胞系、新鲜胃癌组织样本中的表达水平,初步验证了表达谱的结果。近年来,胃癌的发病率和死亡率逐渐下降,但青年人胃癌和食管胃交界腺癌（Adenocarcinoma of theoesophagogastric junction,AEG）患者却明显增多,且二者都有其独特的临床、病理特点,预后也较差。目前关于这两种特殊类型胃癌的深入研究还很少。因此我们从胃癌病例数据库中选择了这样两组特殊人群和类型进行Cyr61与胃癌关系的系列研究,期望能够明确Cyr61在青年人胃癌和食管胃交界腺癌的诊断、分型和/或预后判断中的作用。此外,本研究以4种人胃癌细胞系为研究对象,应用实时定量PCR（Real-Time PCR）技术检测成熟体microRNA（hsa-miR-142-5p）及其预测靶基因Cyr61表达的相关性,非常初步地探讨了可能调控Cyr61异常表达的机制。材料方法收集中国人民解放军总医院病理科1996年1月1日至2005年12月31日的306例胃癌病例,其中青年人胃癌128例,食管胃交界腺癌191例（13例为重复病例）,制作成组织芯片;121例青年人胃癌和54例食管胃交界腺癌获得随访结果。收集10例新鲜胃癌组织标本,其中5例包括癌（T）和癌旁组织（P）及配对正常组织（N）,另5例包括癌（T）和配对正常组织（N）。采用免疫组织化学染色（EnVsion二步法）检测可能与Cyr61相关的CD44、CDX2、β-catenin,PTEN,MMP9,HER1和HER2蛋白在两组胃癌中的表达差异;通过培养并提取6种人胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901、AGS、N87和MKN45,以及10例新鲜胃癌组织标本中的RNA,以RT-PCR技术检测Cyr61的表达水平;细胞免疫荧光检测Cyr61蛋白在人胃癌细胞系BGC823和MGC803中的表达及定位情况;以荧光原位杂交（Fluorescence insitu hybridization,FISH）技术检测HER2在青年人胃癌及食管胃交界腺癌中的扩增情况;在Cyr61异常表达的原因分析方面,以Real-Time PCR技术检测Cyr61及相关成熟体microRNA（hsa-miR-142-5p）在人胃癌细胞系BGC823、SGC7901、AGS和MKN45中的表达水平。采用SPSS 13.0统计软件,对上述数据进行Kaplan-Meier生存分析、COX风险比例模型构建、Spearman相关分析两变量之间的关系,设P＜0.05具有统计学意义。结果青年人胃癌病例的年龄分布为19～40岁,平均年龄为35.6岁,中位年龄为36岁;其中男性患者84例,女性患者44例,男女比例为1.91:1。食管胃交界腺癌病例的年龄分布为28～83岁,平均年龄为59.7岁,中位年龄为60岁;其中男性患者170例,女性患者21例,男女比例为8.1:1。青年人胃癌患者的生存时间为3.4～127.2个月,中位生存时间为24个月;食管胃交界腺癌患者的生存时间为3～86个月,中位生存时间为31个月。影响青年人胃癌患者生存率的因素有性别,脉管癌栓,嗜酸性粒细胞浸润,肿瘤浸润深度,肿瘤最大径,淋巴结转移,远处转移和临床分期;影响食管胃交界腺癌患者生存率的因素有肿瘤浸润深度,淋巴结转移和临床分期。COX生存分析显示肿瘤浸润深度越深（P=0.0076）、伴有淋巴结转移（P=0.0368）和远处转移（P=0.0156）的青年人胃癌患者预后差;食管胃交界腺癌中,肿瘤浸润深度越深（P=0.0458）,伴有淋巴结转移（P=0.0389）的患者预后差。通过RT-PCT检测6种人胃癌细胞系,结果分析Cyr61存在差异表达,于BGC823中表达最高,AGS中最低。在新鲜配对胃癌组织中,Cyr61的mRNA在正常组织中呈低表达趋势,而在胃癌和癌旁组织中有不同程度的上调,与基因表达谱结果一致。Cyr61蛋白定位于胃癌细胞的胞浆,在青年人胃癌组中,Cyr61蛋白的表达水平与性别、WHO分型、Lauren分型、临床分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移均有关,其阳性表达率随肿瘤临床分期增加而增加;在食管胃交界腺癌组中,Cyr61蛋白的表达水平与临床分期、肿瘤浸润深度有关,Cyr61蛋白阳性患者和阴性患者的预后差别有统计学意义（P=0.0001）。在青年人胃癌组中,Cyr61和β-catenin、MMP9及HER2的表达具有相关性（P分别为0.0009、0.0000和0.0000）;β-catenin阳性患者的生存率比β-catenin阴性患者的生存率低（P=0.0314）,PTEN阳性患者的生存率比PTEN阴性患者的生存率高（P=0.0216）,MMP9阳性患者的生存率比MMP9阴性患者的生存率低（P=0.0112）;在食管胃交界腺癌组中,Cyr61和MMP9的表达具有相关性（P=0.0368）,MMP9阳性患者的生存率比MMP9阴性患者的生存率低（P=0.0451）。COX生存分析显示:青年人胃癌组中,MMP9、CD44高表达的患者预后差（P分别为0.0037和0.0006）;食管胃交界腺癌组中,MMP9、Cyr61高表达的患者预后差（P分别为0.0074和0.0004）。hsa-miR-142-5p与Cyr61的相对表达量之间存在负相关性,相关系数为-0.9926（P=0.007）。结论1.Cyr61在胃癌细胞系BGC823,MGC803和SGC7901中高表达,在AGS中低表达;在新鲜胃癌和癌旁组织中的mRNA表达水平均高于正常胃黏膜组织。Cyr61定位于胃癌细胞的胞浆,在青年人胃癌和食管胃交界腺癌中均呈高表达。2.青年人胃癌中,Cyr61在肠型胃癌比弥漫型胃癌表达高,其表达与临床分期呈正相关,临床分期越晚,Cyr61表达越高;Cyr61的表达与β-catenin、MMP9和HER2的表达具有相关性;单因素分析,β-catenin、MMP9阳性、PTEN阴性的患者预后比β-catenin、MMP9阴性、PTEN阳性的患者预后差。多因素分析,MMP9、CD44高表达的患者比低表达的患者预后差。3.食管胃交界腺癌中,Cyr61的表达与临床分期呈正相关,临床分期越晚,Cyr61表达越高;Cyr61阳性表达的患者预后差。单因素分析,MMP9阳性的患者的生存率比MMP9阴性患者的生存率低。多因素分析,MMP9、Cyr61高表达的患者比低表达的患者预后差。4.青年人胃癌的特点是弥漫型胃癌所占比例高,女性更易患弥漫型胃癌,且预后更差。单因素分析影响青年人胃癌预后的因素有性别,嗜酸性粒细胞浸润,脉管癌栓,肿瘤浸润深度,肿瘤最大径,淋巴结转移,远处转移和临床分期;多因素COX风险比例模型中,影响因素有肿瘤浸润深度,淋巴结转移和远处转移。5.食管胃交界腺癌的特点是男性高发,组织学分型以管状腺癌最常见。单因素分析影响食管胃交界腺癌预后的因素有肿瘤浸润深度,淋巴结转移和临床分期;多因素COX风险比例模型中,肿瘤浸润深度和淋巴结转移成为入选因素。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 胃癌病例基本临床病理信息的分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 CYR61/CCN1在胃癌中的异常表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 多种分子标志物在胃癌中的表达及与 CYR61的相关性分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢
• 个人简介