论文摘要
本课题组根据毕赤酵母的信号肽序列，按照酵母偏爱密码，人工合成毕赤酵母的新型信号肽MS，并构建了新型酵母表达载体pPIC9k-MS，构建重组质粒pPIC9k-MS-phyAm-4，然后电击转化毕赤酵母，筛选获得了植酸酶毕赤酵母基因工程菌株pp-MS-NPm-4-16。本研究以麦芽汁培养基、蚕蛹培养基为基础培养基，用于工程菌pp-MS-NPm-4-16高密度培养，结果表明：40％的蚕蛹培养基，190mg╱L的营养盐使酶活比对照高出36.8％。通过对植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-MS-Npm-4-16摇瓶培养条件的研究，实验结果表明，最佳转速为220r／min，最适生长pH和诱导pH分别为5.0和6.0，通过正交实验，结果表明：接种量4％，甲醇浓度4％，豆油浓度（生长阶段）1.3％，豆油浓度（诱导阶段）3.5％为工程菌最适产酶条件，诱导结束时最高酶活达到192.4 ku／ml，是培养条件优化前酶活力的1.6倍。对植酸酶毕赤酵母基因工程菌PP-MS-NPm-4-16在5L发酵罐中的发酵条件包括补料方式、甲醇流速、甘油流速和诱导时间进行研究，确定了它的最佳培养条件。实验结果表明，恒溶氧补料为最佳补料方式，通过正交实验，结果表明：在温度28℃，搅拌750r／min条件下，接种量10％、甲醇流速8 ml／L／h、甘油流速1 ml／L／h、诱导时间84 h为发酵罐的最佳发酵条件，发酵结束时菌体浓度OD600高达175.2，实现了工程菌的高密度发酵，最高酶活达到472.933 ku／ml，是摇瓶培养酶活力的2.458倍，比本课题组报道的植酸酶工程菌PP-NPm-8最高酶活263 ku／ml提高了0.8倍。对植酸酶的耐热性及产品的配制进行了初步研究，发酵液经过冷冻离心除去菌体得到粗酶液，然后添加10mg／ml的甘露醇，采用细米糠作为载体，与发酵液以1：1进行混合，喷涂米糠质量分数20％的Na2SO4，用米糠质量分数0.5％的海藻酸钠进行包被，经过80℃空气热处理0.5h，剩余酶活92.6％。PP-MS-NPm-4-16工程菌高密度发酵培养基成本与酶产量比价为0.005461元／106U，获得5000 u／g的产品价格在18元╱kg左右。本研究得到了植酸酶工程菌的高密度发酵条件和产品配制方法，提高了植酸酶表达量，提高了植酸酶的耐热性，为降低植酸酶生产成本和大规模发酵生产提供了科学依据。
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标签：植酸酶论文; 毕赤酵母基因工程菌论文; 高密度发酵论文; 热稳定性论文;