论文摘要
抗冻蛋白（antifreeze proteins,AFPs）是20世纪60年代从极地冷水鱼血淋巴中分离的一种大分子抗冻剂,迄今为止科学工作者已从陆地昆虫、植物、细菌和真菌等各类生物中分离到多种抗冻蛋白,并测得了其中部分基因序列及一些晶体结构。近些年的工作主要集中在该类蛋白质抗冻机制的研究上。抗冻蛋白是一类抑制冰晶生长的蛋白质,能以非依数性（noncolligative）的形式降低水溶液的冰点,而对熔点影响甚微,从而导致水溶液的熔点和冰点出现差值,这个温度差值被称为热滞值（Thermal hysteresis）,是抗冻蛋白的重要特性之一。抗冻蛋白功能上的三个重要作用是:①具有热滞效应,②改变冰晶的形态,③抑制冰的重结晶。抗冻蛋白具有广泛的应用前景,不但可以应用于食物的冷鲜贮存还可以应用于细胞、器官和组织的低温保存,提高抗冻能力。昆虫AFP的抗冻活性比鱼类和植物的高几十到一百倍。本研究工作主要利用经原核表达的新疆荒漠拟步甲科昆虫准噶尔小胸鳖甲（Microdera punctipennis dzhunarica）的融合抗冻蛋白作为抗冻保护剂,添加到待保存食用菌种酿酒酵母中,使菌种在普通冰箱能达到的温度下,延长保存时间,提高菌种的存活率,使菌种的保存更具有普遍性和降低保存成本。首先,利用pMAL-p2X原核表达载体,将本实验室已克隆获得的准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因,简称MpAFP698,成功地在大肠杆菌BL21中表达,用Amylose Resin亲和层析纯化获得了较纯的抗冻融合蛋白MBP-MpAFP698（MBP是麦芽糖结合蛋白）;采用Bradford法进行蛋白定量,纯化得到了浓度为700μg/mL～3000μg/mL的融合蛋白;通过纳升渗透压仪观察抗冻蛋白MBP-MpAFP698的冰晶形态,冰晶呈针状,结果与抗冻蛋白的冰晶形态效应一致,说明MBP-MpAFP698蛋白具有较高活性。沸水浴10min MBP-MpAFP698表现出很高的热稳定性,研究结果为下一步菌种保存实验提供了材料。其次,利用纯化出的抗冻蛋白MBP-MpAFP698对食用菌种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行低温下保存。将终浓度为50μg/mL抗冻蛋白,添加到菌液中,置于-20℃不同的时间,观察其对酵母菌的抗冻保护效果。初步验证纯化出的抗冻蛋白是有活性的;在-20℃和-7℃时,不同浓度MBP-MpAFP698（1μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、70μg/mL等）对酵母菌都有较好的保护效果,最小保护浓度为1μg/mL,说明抗冻蛋白活性极高,当浓度为10μg/mL时保护效果最佳;在此基础上,选取10μg/mL分别在-50℃、4℃和0℃进行菌种保存实验,结果表明在-50℃实验组与对照组差异显著,在4℃和0℃实验组与对照组差异不显著;实验进一步探讨了在抗冻蛋白在-20℃对酵母菌的最长保护时间,结果表明抗冻蛋白的保护效果在50天以上。实验结果为抗冻蛋白在菌种保存中的应用奠定了基础。最后,研究了抗冻蛋白对酿酒酵母和小鼠生长的影响,初步说明了MBP-MpAFP698对酿酒酵母的生长,以及小鼠的生长均无显著影响。实验结果为昆虫抗冻蛋白安全性评估奠定一定基础。