五味子乙素增敏蒽环类的抗肿瘤作用和减轻其心肌毒性的体内外实验研究

论文摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病。肿瘤化疗是肿瘤治疗的主要手段之一。然而，肿瘤化疗有两个重要问题有待解决，肿瘤的多药耐药性和化疗药的毒副作用。肿瘤的多药耐药性（multidrug resistance,MDR）)是肿瘤化疗失败的主要原因之一。肿瘤多药耐药性的主要机理是肿瘤细胞高表达药物转运蛋白，如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多药耐药相关蛋白1（Multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）等，这些‘药泵’将进入肿瘤细胞内的化疗药单向排出细胞外，肿瘤细胞因此获得耐药性。化疗药的毒副作用也是干扰肿瘤化疗成功的不可忽略的因素，最突出的是蒽环类药物的心肌毒性。蒽环类药物具有很强的抗肿瘤药效，用于多种实体瘤和白血病的治疗，到目前为止，其在临床肿瘤化疗的地位和作用是不可替代的。然而，该类药物可造成相当数量病人永久性的心肌损伤，表现在其严重的急性、亚急性、慢性心肌毒性。其他抗癌药物（泰素、Trastuzumab、cox-2抑制剂）与蒽环类药物联用可造成后者更大的心肌毒性。克服肿瘤MDR同时预防蒽环类药物的心肌毒性是提高化疗疗效的一个关键。目前已有数个逆转肿瘤MDR的药物进入临床和临床前实验，但尚无一个上市。仅有一个预防蒽环类心肌毒性的药物Dexrazoxane（ICRF-187）获得美国FDA批准上市。然而该药是否会干扰蒽环类药物的抗癌药效，对骨髓细胞是否有致癌作用，是否会增加蒽环类药物对正常血细胞的毒性，是目前担心的问题，事实上已有证据提出该药可能会降低蒽环类药的抗癌药效。因此，临床肿瘤化疗迫切需要兼有预防蒽环类心肌毒性和克服肿瘤MDR作用的药物。在体外能够逆转肿瘤MDR的化合物有很多，也有一些能够降低蒽环类药物心肌毒性的化合物。然而，这些化合物的作用只是单一的，即，只逆转肿瘤MDR或只降低蒽环类药物的心肌毒性；或这些化合物有可能在预防心肌毒性的同时干扰蒽环类药的抗癌药效。到目前为至，在公开的文献中尚无报道一个化合物可同时预防蒽环类化合物的心肌毒性并增强后者的抗癌活性。可以预计，能同时兼有这两种功能的药物有非常广阔的临床应用前景。联苯环辛二烯类木脂素是从五味子属植物来源的一类天然化合物。我们在前期的工作中发现该类化合物是一类新的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）抑制剂，而P-gp是介导临床肿瘤多药耐药性的主要原因。由于P-糖蛋白与MRP1有相似结构域和相似的转运功能，近年来国内外许多实验室都在用P-糖蛋白抑制剂作用于MRP1，但目前大多数的P—糖蛋白抑制剂对MRP1并无明确的逆转效果，例如CsA。但也有研究表明，化合物VX-710，MS209能够同时抑制PgP和MRP1的功能。临床上对药效明显、毒性低的双重耐药抑制剂的需求，以及联苯环辛二烯类木脂素对P-糖蛋白介导的肿瘤细胞MDR有明确的体外逆转效果这一事实，使得我们考虑联苯环辛二烯类木脂素对MRP1的抑制作用。本研究中，我们进一步证明了联苯环辛类木脂素具有逆转肿瘤多药耐药相关蛋白（multidrug-resistance associated protein，MRP1）的功能。并研究了联苯环辛二烯类木脂素中的主要成员五味子乙素（Sch B）是否增加以阿霉素为代表的蒽环类药物的抗肿瘤活性，并且对后者引起的心肌毒性的影响进行了研究。蒽环类抗肿瘤药在心肌细胞内产生的超氧负离子、ROS、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等是造成心肌细胞损伤的主要原因。同时，心肌细胞内触酶（catalase）的活性很低，因此去除ROS主要靠谷胱甘肽过氧化物酶（GSH peroxidase，GSH-Px）。然而，蒽环类药可使心肌细胞内GSH-Px失活，进一步导致心肌细胞内ROS积累，加重损伤。有效去除心肌细胞内的ROS是预防蒽环类药心肌毒性的关键。由于五味子乙素具有促进细胞内GSH氧化还原循环（GSH redox cycle）的功能。GSH是细胞内最重要的抗氧化剂，而GSH氧化还原循环是细胞内最重要的抗氧化机理。可以推测，五味子乙素的抗氧化作用有可能预防阿霉素的心肌毒性。因此若能证明五味子乙素能预防蒽环类药物的心肌毒性，五味子乙素将是至今为止发现的唯一一个具有克服肿瘤多药耐药性、增加抗癌药药效、预防蒽环类药物心肌毒性多重功能的候选药物，具有明显的优势和良好的药物发展前景。本研究首先进行体外试验，以HL-60／ADR和HL-60／MRP为研究对象，从细胞水平对五种联苯环辛二烯类木脂素逆转MRP1的作用进行了探讨；进而以SMMC7721细胞细胞为研究对象，试图从分子和细胞水平对Sch B促进阿霉素（DOX）诱导细胞凋亡的作用及其可能的机制进行研究；接着以小鼠和大鼠为研究对象，从几方面评价Sch B和DOX联用的作用效果：1．探讨在S180荷瘤小鼠，Sch B对DOX的抗肿瘤作用的增敏作用及可能的作用机制及Sch B对DOX造成的心肌损害和其它毒副作用的保护作用；2．探讨在ICR小鼠，Sch B对DOX所致鼠的急性心肌损伤的保护作用，并从抗氧化等方面探讨其机制；3．探讨在S-D大鼠，Sch B对DOX所致急性心肌损伤鼠的心功能的影响。希望通过这一系列体内外实验研究，分别从分子、细胞和组织水平阐明联苯环辛类木脂素增强以阿霉素为代表的蒽环类的抗肿瘤作用及减轻其心肌毒性的可能机制，为联苯环辛类木脂素的临床应用提供理论依据。第一部分联苯环辛二烯类木脂素逆转MRP1耐药的研究取HL60／ADR和HL60／MRP细胞系培养，流式细胞仪（FCM）测定五种联苯环辛二烯类木脂素单体（五味子甲素、乙素、醇甲、醇乙、酷甲）对柔红霉素（DNR）、长春新碱（VCR）和依托泊甙（VP16）抑制细胞生长及同一浓度五种联苯环辛二烯类木脂素单体对不同化疗药物抑制HL60／ADR和HL60／MRP细胞生长的影响；FCM检测五种联苯环辛二烯类木脂素单体作用前后，HL60／ADR和HL60／MRP细胞内化疗药物DNR和MRP1特异性底物CFDA积聚的变化。结果如下：1．五味子甲素、乙素、醇甲、醇乙、酯甲可有效降低HL60／ADR、HL60／MRP对DNR、长春新碱（VCR）和VP16的IC50，逆转倍数2到70倍不等；2．五味子甲素、乙素、醇甲、醇乙、酯甲能够增加DNR和MRP1特异性底物CFDA在细胞内的积聚。第二部分五味子乙素促进阿霉素诱导细胞凋亡的研究取SMMC7721细胞系培养，用不同浓度的SchB处理48hrs，采用MTT法测定Sch B对细胞存活影响：流式细胞仪PI染色测定细胞周期和细胞凋亡率；用DOX、Sch B、两药联用及caspase抑制剂zVAD-FMK处理后，流式细胞仪PI染色测定凋亡率；R-藻红蛋白标记测定P糖蛋白表达，Rhodanmin123（Rh123）标记检测线粒体膜电位变化；流式细胞仪测定Sch B对DOX积聚外排的影响；RT-PCR检测SMMC7721和MCF-7细胞内各主要耐药基因mrp1，mdr1的mRNA表达；Western Blot检测药物作用后相关蛋白（caspase-3，-8，-9和PARP）表达。结果表明：1．在SMMC7721细胞，双药联用组的早期及晚期凋亡细胞比例均较单用DOX组显著增加，单用DOX组的早期凋亡率是5.1±2.8％，晚期凋亡率是15.5±4.3％，而Sch B联用DOX组的早期凋亡率是12.2±1.1％，晚期凋亡率是27.0±6.7％。因该浓度下单独使用Sch B并不促进凋亡，此结果显示Sch B能够增大DOX的凋亡诱导能力。2．在大鼠正常心肌细胞，双药联用组的凋亡率与单用DOX组没有差别。单用DOX组的凋亡率是7.8±2.1％，而Sch B联用DOX组的凋亡率是8.82±1.03％，同样的结果在人成纤维细胞也得到。说明Sch B不能促进DOX诱导的正常细胞凋亡。3．采用Real time RT—PCR方法检测SMMC7721细胞中MDR1 mRNA的表达，在经过DOX处理12h，24h或48h后，可以检查到有不同程度的表达，但还不到阳性对照的0.1％。在经过不同时间DOX处理后，流式细胞仪检测显示，P糖蛋白无表达。因此，Sch B的增敏效果不是通过抑制P糖蛋白实现的。采用RT—PCR方法检测SMMC7721细胞中MRP1mRNA的表达，用DOX处理的不同时间段的SMMC7721细胞均未检测到MRP1mRNA的表达。说明Sch B的增敏效果亦不是通过抑制MRP1实现的。SMMC7721细胞在5μMDOX中孵育，再加入50μM的SCh B，作用30min，60min，90min，120min后FCM检测，发现有无SchB对细胞内DOX的积聚没有影响。同样的结果在DOX的外排试验中亦发现。说明Sch B的增敏作用与DOX的相关药泵无关。4．SMMC7721细胞和DOX／SchB共同孵育，加入／不加入caspase总抑制剂zVAD-FMK，作用48h，PI染色，FCM检测发现zVAD-FMK不仅能够抑制DOX单独作用诱导的凋亡，双药联用诱导的凋亡率也有下降。说明Sch B促进DOX诱导的凋亡是Caspase依赖的。5．Western Blot结果显示，双药联用处理SMMC7721细胞后，可见procaspase-3条带较其它各组减弱，提示Caspase-3切割活化增强，而Sch B组并未出现条带减弱。同样在双药联用处理后，可见PARP切割较其它组增强。这一结果与Caspase-3结果相符。单用Sch B处理SMMC7721细胞，对procaspase-8和-9均没有活化作用。双药联用处理细胞后，Caspase-8的激活与DOX单药组相比无明显增加，而Caspase-9的激活条带较DOX单药组有显著增强。药物处理48小时后，流式细胞仪检测Rh123荧光强度，Sch B单药组平均荧光值为398.34±5.65，与对照组（408.46±5.22）无显著差异（P＞0.05）：DOX单药组平均荧光强度为360.55±3.65，较对照组有显著降低（P＜0.01）。双药联用组平均荧光值为270.08±3.93，较对照组和DOX单药组均有降低，且具有显著差异（P＜0.01）。这些结果说明Sch B的加入增强了线粒体膜电位变化，也进一步证实了Sch B所促进的凋亡现象是通过caspase-9介导的线粒体途径进行的。6．SMMC7721细胞，分别用DOX、米托恩醌和长春新碱（VCR）并联用／不联用Sch B处理。结果表明，SchB对这三种药物的增敏作用是无差別的，证明Sch B的促凋亡作用与ROS的产生是无关的。第三部分五味子乙素对荷瘤小鼠化疗增效减毒的研究取S180细胞体外培养，用不同浓度的DOX和SchB处理48hrs，采用MTT法测定Sch B对细胞存活影响；ICR小鼠体内保种的S180细胞，腋下注射，称重后随机分组。分为S180对照组、Sch B组、DOX组、DOX+Sch B1组，DOX+Sch B2组，12只／组，灌胃给不同剂量Sch B（100mg／kg和50mg／kg），间隔小于2小时，腹腔注射给DOX2mg／kg，隔日一次，连给7次。共给药13天。2天测1次动物体重、肿瘤体积。在最后一次给DOX24h即第14天后，动物挖眼球取血，脱臼处死。血标本离心取上清，一80℃冻存。肿瘤组织，心，肝，肾，脾，胸腺取出，称重，福尔马林固定保存。血清CK、LDH、SOD、MDA、AST的测定用试剂盒，按说明书操作。结果表明：1．体外细胞培养，应用Sch B单独作用S180细胞，浓度达到200uM未见细胞毒性。单独应用DOX可见明显浓度依赖的细胞毒性，而Sch B联用DOX组的细胞存活率较单用DOX组有明显下降（P＜0.05）。2．给药后第6天开始测肿瘤体积。其中DOX组及DOX+Sch B联用2个剂量组的肿瘤体积比S180对照组明显减小，差异有显著性（P＜0.05），随时间延长，DOX组及联用组的肿瘤体积与S180对照组肿瘤体积之间的差异越来越大，到第14天，联用2个剂量组的肿瘤体积与单独应用DOX组相比均有显著性差异（P＜0.05），而单独应用SchB对肿瘤体积没有明显影响（见图2-3）。单独应用DOX组的小鼠瘤重比S180对照组有明显下降，差异有显著性（P＜0.05），联合应用Sch B组，瘤重下降更明显，100mg／kg比50mg／kg效果更好，与单独应用DOX相比，差异亦有显著性（P＜0.05），单独应用Sch B对肿瘤重量没有明显影响。说明Sch B无抗肿瘤作用，Sch B有增敏DOX抗S180肿瘤的作用。3．随时间延长，小鼠体重逐渐增加，其中S180对照组体重增加最明显，DOX对小鼠体重的抑制作用最明显，联合应用Sch B组的体重较单用DOX组有所增加，从第8天开始，S180对照组及联用2个组的小鼠体重与单独DOX组相比均有显著性差异（P＜0.05）。4．小鼠处死，取胸腺、心，肝，脾，肾进行称重，发现DOX组各器官重量比其它组明显减轻，而DOX联用Sch B组各脏器重量较之有不同程度增加，胸腺和肝，100mg／kg的Sch B+DOX联用组与单用DOX组相比，差异有显著性（P＜0.05），而肾脏，2个剂量的Sch B+DOX联用组与单用DOX组相比，差异均有显著性（P＜0.05），提示Sch B有减轻DOX的毒副作用和提高免疫功能的潜力。5．DOX 2mg／kg，隔日一次，连用7次，引起血清心肌酶谱CK，LDH，GOT和MDA不同程度的升高，SOD下降，并与对照组有显著性差异（P＜0.05）。对于CK和LDH，联用2个剂量组与单用DOX组相比均有下降，而Sch B（100mg／kg）联用组与单用DOX组相比有显著性差异（P＜0.05）；对于GOT和MDA，联用2个剂量组与单用DOX组相比均有显著性差异（P＜0.05）。而对于SOD，联用2个剂量组与单用DOX组相比均有明显升高，，而Sch B（100mg／kg）联用组与单用DOX组相比有显著性差异（P＜0.05）。故提前给予SchB，可以不同程度的减轻心肌酶谱各指标的改变。对照组和Sch B组的CK、LDH、GOT、MDA和SOD等5项血清心肌酶谱指标均无显著性差异（P＞0.05）。说明Sch B单独应用对动物机体没有影响。第四部分五味子乙素减轻阿霉素心肌毒性的小鼠体内研究采用随机分组法将216只ICR小鼠分为6组，（1）对照组、（2）SchB组、（3）DOX组、（4）Dox+SchB1组、（5）Dox+SchB2组和（6）Dox+SchB3组，前3组灌胃生理盐水、后3组灌给不同剂量SchB（100mg／kg、50mg／kg和25mg／kg）即分别为高剂量、中剂量和低剂量，1天／次，连灌3天，第3天，灌胃后2小时内，腹腔注射给DOX 25mg／kg。于腹腔注射DOX后48h，各组取一部分小鼠，摘眼球取血，常规分离血清，-80℃冻存，在全自动生化分析仪上测定CK、CK-MB、LDH和GOT；采血后，处死取心脏，分离左心室，洗净擦干称重，-80℃冻存，参照文献提取组织蛋白质，明胶酶谱法测定MMP的表达；于腹腔注射DOX后第5d，常规取小鼠左心室心肌，制成组织匀浆，心肌组织MDA、GST、GSH-PX、GR、CAT、SOD、GSH／GSSG检测均采用试剂盒，按说明书操作；取小部分左心室心肌组织透射电镜观察心肌超微结构的变化并摄片；余下的小鼠，从给DOX那天算起，共观察7天，记录小鼠的状态和生存率的变化。结果表明：1．DOX组的血清酶指标CK、CK-MB、LDH、GOT均显著高于对照组（P＜0.05）。DOX联用SchB的3个剂量组血清酶学指标均较DOX组有不同程度降低，其中高剂量SchB联用DOX组的此4项血清酶学指标与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05），而与单用DOX组明显增高的血清酶相比较，均有显著性差异（P＜0.05）；中剂量SchB联用DOX组和低剂量SchB联用DOX组的CK、CK-MB和LDH指标与单用DOX组相比较，有显著性差异（P＜0.05）；对照组和SchB组的此4项血清心肌酶谱指标均无显著性差异（P＞0.05），说明Sch B可以减轻DOX造成的心肌酶改变，而对正常心肌没有影响。2．对照组未检测到MMP表达，DOX组MMP-2表达升高，SchB联用DOX3个剂量组MMP-2表达较DOX组明显降低，说明联用SchB显著抑制DOX引起升高的MMP-2明胶酶活性，其中高剂量SchB联用DOX组抑制效果最好。3．DOX组心肌组织匀浆中GS7、GR、GSH-PX、SOD、GSH较对照组有不同程度的下降，MDA和GSSG较对照组升高，并有显著性差异（P＜0.05）。对照组和SchB组的MDA、GST、GR、GSH-PX、CAT、SOD、GSH和GSSG等8项心肌组织的相关酶指标均无显著性差异（P＞0.05）。对于MDA，DOX联用SchB的3个剂量组与单用DOX组相比均有明显下降且有显著性差异（P＜0.05）；而对于GST和SOD，高剂量SchB联用DOX组和中剂量SchB联用DOX组均比单用DOX组有明显升高，有显著性差异（P＜0.05）；对于GR和GSH-PX，只有高剂量SchB联用DOX组与单用DOX组相比有显著性差异（P＜0.05）：DOX引起CAT的改变与对照组相比没有显著性差异（P＞0.05），DOX联用SchB的3个剂量组与单用DOX组相比亦无显著性差异（P＞0.05）；对于GSH，DOX联用SchB的3个剂量组与单用DOX组相比均有明显升高且差异有显著性P＜0.05)；对于GSH／GSSG，DOX联用SchB的3个剂量组与单用DOX组相比均有明显升高且差异有显著性P＜0.05)；对于TGSH，高剂量SchB联用DOX组与单用DOX组相比有显著性差异（P＜0.05）；而对于GSSG，DOX联用SchB的3个剂量组与单用DOX组相比均有不同程度的降低，但没有显著性差异（P＞0.05）。说明DOX联用SchB的3个剂量组心肌组织匀浆中相关酶学指标均较DOX组有不同程度的改善，SchB有减轻DOX造成的小鼠急性心肌损伤的心肌匀浆中与氧自由基有关的指标改变的作用。4．透射电镜显示：对照组心肌超微结构正常，DOX组心肌细胞肿胀，细胞核扩大，肌纤维走向紊乱、变细，肌丝断裂溶解，肌节不清，线粒体肿胀、畸形，空泡，嵴排列紊乱，嵴减少，消失，肌浆网扩张、空泡化。DOX联用SchB的3个剂量组心肌病变较单用DOX组减轻，肌纤维排列基本上整齐，肌节可见，肌丝排列尚有序，线粒体嵴轻度受损，散在性的线粒体肿胀、轻度空泡化和散在性的肌质网扩张。提示Sch B有减轻DOX造成急性心肌损伤小鼠的病理学改变的作用。5．给予DOX后第7天，DOX组生存率为16.7％，高剂量SchB联用DOX组生存率为50％，中剂量SchB联用DOX组生存率为41.7％，低剂量SchB联用DOX组生存率为33.4％。说明Sch B可以延长DOX造成急性心肌损伤小鼠的寿命。第五部分五味子乙素对阿霉素急性心肌损伤大鼠心功能影响的研究取42只S-D大鼠，随机分为3组，即对照组，DOX组和Sch B+DOX组，先给SchB+DOX组灌胃SchB100mg／kg，另2组灌生理盐水，1天／次，连灌3天，第3天，灌胃后2小时内，腹腔注射给DOX 20mg／kg。5天后，颈动脉插管，利用MedLab—U／4c生物信号采集处理系统采集左心室内压并分析。结果表明：与对照组相比，DOX组LVSP、LVEDP、±dp／dt均显著降低（P＜0.05），说明DOX对心肌造成了严重损伤。Sch B干预组与DOX组比较，LVSP、LVEDP、±dp／dt均升高并有显著性差异（P＜0.05）。表明Sch B可以改善左心室的收缩和舒张功能，对DOX导致的急性心肌损伤有较好的治疗作用。结论：1．联苯环辛二烯类木脂素是一类新的MRP1逆转剂。2．Sch B，联苯环辛二烯类木脂素的一种，能够显著促进阿霉素在人肝癌细胞系SMMC7721诱导的凋亡，并且这种增敏作用与其对P糖蛋白的抑制作用无关，也与ROS的产生无关，是通过caspase-9的激活介导的。而在相同试验条件下，Sch B对大鼠正常心肌组织细胞和人成纤维细胞却没有促进凋亡的作用。3．在S180荷瘤小鼠，Sch B显著增敏阿霉素的抗肿瘤作用和减轻其心肌毒性。4．在急性心肌损伤小鼠和大鼠模型，Sch B明显减轻阿霉素诱发的心肌损伤，包括延长生存率，改善心功能，减轻血清心肌酶和心肌匀浆自由基损伤相关指标的改变。Sch B作用的机制可能是通过维持包括GSH氧化还原循环和SOD在内的细胞抗氧化酶的活性来减轻由于阿霉素对心肌细胞的脂质过氧化造成的损伤。5．五味子乙素，是目前为止被发现的唯一一个同时具有逆转耐药和减轻蒽环类的心肌毒性的药物。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验设备、材料与试剂
• 第一部分 联苯环辛二烯类木脂素逆转MRP1耐药的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 五味子乙素促进阿霉素诱导SMMC7721细胞凋亡的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 五味子乙素对荷瘤小鼠化疗增效减毒的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 五味子乙素减轻阿霉素心肌毒性的小鼠体内研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第五部分 五味子乙素对阿霉素急性心肌损伤大鼠心功能影响的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 综述 蒽环类药物抗肿瘤作用和心脏毒性防治的研究进展
• 在读期间发表文章
• 致谢