产黄青霉谷胱甘肽转移酶基因的克隆、表达与功能研究

论文摘要

谷胱甘肽转移酶（glutathione transferase,GST,EC 2.5.1.18）是具有多种生理功能的二聚体同功酶家族,催化细胞内的谷胱甘肽与各种内源或外源的亲电子有毒分子结合以达到解毒的目的。目前有关GST的研究大多集中在动物、植物、昆虫等生物体中,而对于真菌尤其是丝状真菌中的产黄青霉（Penicillium chrysogenum Thom）GST的报道较少。本研究以产黄青霉cDNA为模板,克隆得到了两个新的谷胱甘肽转移酶基因PcgstB和PcgstC,与GenBank中已知序列进行BLASTp比较显示,二者均具有保守的GST结构域。将基因PcgstB和PcgstC分别与载体pTrc99A和pET-39b（+）连接,构建了两种目的基因的原核表达载体,转化大肠杆菌,经IPTG诱导后获得了重组蛋白PcGstB和PcGstC。分别采用glutathione-agarose亲和层析及包涵体溶解、复性的方法,对表达的重组蛋白进行了纯化,并以1-chloro-2,4-dinitrobenzene（CDNB）为底物检测纯化蛋白PcGstB和PcGstC的比活分别为0.401±0.020U/mg和0.018±0.0017U/mg,表明二者均具有GST活性。采用实时定量PCR检测,结果表明在产黄青霉培养基中加入CDNB 3h后,基因PcgstB和PcgstC的表达量分别增加了大约2倍和10倍,而PAA和H2O2对PcgstB和PcgstC基因的表达水平无显著影响。对PcGstC蛋白的酶促反应动力学研究显示,以CDNB为底物测得蛋白的Km（CDNB）值为1.66μmol/ml、Vmax（CDNB）为0.0422μmol/min/mg,以GSH为底物测得蛋白的Km（GSH）值为1.73μmol/ml、Vmax（GSH）为0.0432μmol/min/mg。底物特异性研究表明,除CDNB外,PcGstC同样能够催化p-Nitrobenzyl chloride （ NBC ）、Ethacrynic acid （ EA ）和4-Nitropyridine-N-oxide（NPNO）与GSH（glutathione,谷胱甘肽）结合,其比活分别为:0.137±0.005U/mg、0.028±0.003U/mg、0.069±0.006U/mg,而对1,2-Dichloro-4-nitrobenzene（DCNB）无活性。本研究结果为深入研究产黄青霉中GST与GSH、苯乙酸代谢的关系及其在青霉素生物合成中的作用奠定了基础,并为利用基因工程手段进行青霉素生产菌种改良工作提供了理论依据,同时也丰富了人们对GST基因家族进化的认识。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一部分 文献综述
• 一 青霉素及其生物合成概述
• 二 谷胱甘肽转移酶概述
• 第二部分 研究报告
• 前言
• 第一章 产黄青霉 GST 编码基因 PcgstB、PcgstC cDNA 的克隆及结构分析
• 1 实验材料与设备
• 2 实验方法
• 3 实验结果及分析
• 4 小结
• 第二章 PcgstB 和PcgstC 的原核表达、蛋白纯化及活性鉴定
• 1 实验材料与设备
• 2 实验方法
• 3 实验结果及分析
• 4 小结
• 第三章 PcgstB 和PcgstC 基因表达研究
• 1 实验材料与设备
• 2 实验方法
• 3 实验结果及分析
• 4 小结
• 第四章 PcGstC 酶学研究
• 1 实验材料与设备
• 2 实验方法
• 3 实验结果及分析
• 4 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历