极细链格孢菌功能基因HIS3及LEU2的初步研究

论文摘要

极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）是一种植物病原真菌,对农业生产危害巨大,然而其在生防、环保等方面也有应用,因此从分子水平研究该菌的功能基因的调控机制,对进一步开发利用该菌具有重要意义。在真核微生物的遗传学研究中LEU2和HIS3基因是重要的营养标记,通过遗传学手段,我们筛选获得了极细链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因,并且研究了AtLEU2及AtHIS3基因互补酿酒酵母的功能。以G418抗性基因作为选择标记,构建了用于敲除极细链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的质粒,建立了极细链格孢菌的遗传转化系统,为进一步研究AtLEU2及AtHIS3基因的功能奠定了坚实的基础,主要研究结果如下:1、将极细链格孢菌cDNA表达文库转化到酵母LEU2缺失突变株,用SD-LEU培养基进行筛选,获得了3个正常生长的酵母转化子。对转化子质粒进行测序分析,发现这些基因编码的蛋白质序列均与酵母LEU2（ScLEU2）基因编码的363个氨基酸同源（命名为AtLEU2,其编码的蛋白质命名为Atleu2p）,该基因编码的蛋白与植物病原菌小麦颖枯病CAB72262;灰葡萄孢霉EDN21270;玉蜀黍赤XP386851,以及水稻稻瘟病病菌XP367617所编码的β-苹果酸脱氢酶同源,相似性分别达到94%、74%、1%和69%,与酿酒酵母、粗糙链孢霉EAA33847相似性为70%和63%。2、将极细链格孢菌cDNA表达文库转化到酵母HIS3缺失突变株,在SD-HIS培养基上筛选,获得了2个正常生长的转化子。所得基因的开放阅读框（ORF）含有717个碱基,编码238个氨基酸,与酵母HIS3（ScHIS3）基因同源（命名为AtHIS3,其编码的蛋白质命名为AtHis3p）,AtHis3p与植物病原真菌链格孢BAF69039,小麦颖枯病EAT83561,灰葡萄孢霉EDN23196,玉蜀黍赤霉XP386269,以及水稻稻瘟病病菌XP367617中编码的咪唑甘油磷酸脱水酶同源,相似性分别达到100%,90%,68%,65%和63%;与生防菌哈茨木霉P34041相似性达64%;与酿酒酵母,粗糙链孢霉XP961386编码的蛋白相似性达64%和66%。3、分别选择以AtLEU2及AtHIS3基因上下游同源序列500 bp左右作为同源臂,在上游同源序列3’端连接G418抗性基因（以保证缺失突变株的检测及鉴定）,构建了用于敲除极细链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的质粒,为在极细链格孢菌中敲除AtLEU2及AtHIS3基因奠定了坚实的基础,为进一步研究链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的功能及作用机理提供了重要的试验材料。4、基于极细链格孢菌在含有G418（100μg/mL）的PDA培养基上不能生长的药物敏感性实验结果,建立了用G418抗性基因作为选择标记的遗传转化系统,从而为研究极细链格孢菌功能基因的敲除、缺失突变株鉴定提供了可靠的筛选标记,并为后续研究打下必要的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 研究进展
• 1.1 链格孢菌研究概况
• 1.1.1 链格孢菌的危害
• 1.1.2 次生代谢物—毒素
• 1.1.3 应用前景
• 1.1.3.1 生物防治
• 1.1.3.2 降解作用
• 1.1.3.3 生物源除草剂
• 1.1.3.4 蛋白激发子
• 2 极细链格孢菌功能基因的研究
• 3 丝状真菌的转化
• 3.1 研究概况
• 3.1.1 转化方法
• 2/PEG介导的原生质体的转化'>3.1.1.1 CaCl₂/PEG介导的原生质体的转化
• 3.1.1.2 基因枪的转化
• 3.1.1.3 限制酶介导的转化
• 3.1.1.4 根癌农杆菌介导的转化（ATMT）
• 3.1.1.5 电转化法
• 3.2 转化中的选择标记
• 第二章 编码LEU2和HIS3基因的极细链格孢菌cDNA文库分离和鉴定
• 1 实验材料
• 1.1 菌株及质粒
• 1.2 培养基
• 2 试验方法
• 2.1 极细链格孢菌cDNA表达文库质粒转化酵母缺失菌株
• 2.2 AtHIS3基因及AtLEU2基因的cDNA分离
• 2.2.1 极细链格孢菌cDNA表达文库初步筛选
• 2.2.2 酵母质粒的提取
• 2.2.3 细菌转化
• 2.2.4 细菌质粒提取
• 2.3 酵母质粒（DH5α）复验检测
• 2.3.1 酵母质粒（DH5α）BsrGI酶切检测
• 2.3.2 酵母质粒（DH5α）转化酵母缺失突变菌株
• 3 实验结果
• 3.1 转化效率及转化子数量
• 3.2 BsrGI酶切酵母质粒（DH5α）
• 3.3 酵母质粒（DH5α）互补酵母缺失株
• 3.4 酵母质粒（DH5α）测序结果分析
• 4 结论与讨论
• 第三章 极细链格孢菌LEU2及HIS3基因敲除质粒构建及原生质体转化体系的建立
• 1 实验材料
• 1.2 主要试剂、酶及载体
• 1.3 培养基和试剂
• 2 实验方法
• 2.1 链格孢菌药物敏感性试验
• 2.1.1 菌株活化
• 2.1.2 药物敏感性试验
• 2.2 LEU2和HIS3基因敲除质粒构建
• 2.2.1 LEU2及HIS3基因同源片断的亚克隆
• 2.2.1.1 引物的设计
• 2.2.1.2 PCR扩增目的片段
• 2.2.1.3 PCR产物的连接与转化
• 2.2.1.4 阳性克隆的确定
• 2.2.1.4.1 菌液PCR的鉴定
• 2.2.1.4.2 酶切法确定T载体插入片段
• 2.2.3 pGL-b和pGH-a质粒的构建
• 2.2.4 pGH-a-b和pGL-b-a质粒的构建
• 2.3 原生质体转化体系的建立
• 2.3.1 原生质体的制备
• 2.3.2 原生质体的转化
• 2.3.3 G418抗性筛选及稳定性测试
• 2.3.4 转化子的验证
• 3 实验结果
• 3.1 药物敏感性测定
• 3.2 LEU2基因敲除质粒的构建
• 3.2.1 PCR产物的连接与转化
• 3.2.2 pGL-b的构建
• 3.2.3 pGL-b-a质粒的构建
• 3.3 HIS3基因敲除质粒的构建
• 3.3.1 PCR产物的连接和纯化
• 3.3.2 pGH-a的构建
• 3.3.3 pGH-a-b质粒的构建
• 3.4 原生质体转化体系的建立
• 3.4.1 原生质体的制备
• 3.4.2 转化与转化子的鉴定
• 3.4.3 转化子的检测
• 4 结论与讨论
• 4.1 筛选标记
• 4.2 敲除质粒的构建
• 4.3 原生质体转化体系的建立
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文