茶树中三个与茶尺蠖取食诱导相关的肉桂醇脱氢酶（CAD）基因克隆与功能分析

论文摘要

木质素是由多种简单的苯丙烷及其衍生物聚合形成的复杂聚合物，其通过有效物理化学屏障在植物抵抗病、虫害侵入中起着重要作用。而肉桂醇脱氢酶（CAD）是控制木质素生物合成途径的关键酶之一，然而茶树体内CAD基因相关研究及其与抗虫性之间的关系研究至今未见报道。本论文主要对茶树叶片中的三个与茶尺蠖取食诱导相关的CAD基因进行了cDNA克隆，鉴定和表达特征分析。主要结果如下：1．基于本课题组建立的茶树被茶尺蠖取食诱导前后的cDNA消减杂交文库（SSH）和茶树全器官转录组库获得的3条与CAD基因同源性很高的EST序列，利用RACE技术分别克隆了编码CAD基因的全长cDNA序列，其中1条来自于SSH编码的CAD命名为CAD2，2条来自于转录组库编码的CAD分别命名为CAD1和CAD3。CAD2基因全长为1574bp，开放阅读框972bp，编码324个氨基酸；CAD1基因全长为1386bp，开放阅读框1146bp，编码382个氨基酸； CAD3全长为1350bp，开放阅读框1083bp，编码361个氨基酸。并将三个基因的序列递交到GenBank，登录号分别为HM440158、HQ880207和HQ880208。2．多序列同源比对和蛋白质结构预测分析表明， CAD1和CAD3之间同源性为54%，而两者与CAD2同源性比较低，仅为20%。只有CAD1和CAD3含有二者共有的3个保守的功能结构域：Zn1结合位点[GHE（X）2（X）5G（X）2V]， Zn2结合位点[GD（X）9.10C（X）2C（X）2C（X）7C]和NADPH辅酶结合位点[GXG（X）2G]；仅CAD2含有依赖于NADPH的表异构酶/脱水酶家族的氧化还原酶功能结构域。进化树分析结果表明，CAD1、CAD2和CAD3分属于3个不同的家族。3．原核表达结果表明，CAD2基因表达的蛋白大部分是分布于上清的可溶性蛋白，分子量为53kD，而CAD1和CAD3基因表达的蛋白皆形成包涵体，分子量分别为59kD与56kD。酶活测定结果发现，三个CAD基因表达的蛋白质具有不同的催化活性，其中以CAD2活性最高，为0.43μmol·min-1· mg-1， CAD3次之，为4.2nmol·min-1· mg-1， CAD1最小，为3.8nmol·min-1· mg-1。 CAD2的最适pH为6，最适温度为30℃，酶动力学参数Km为1.974μmol·L-1， Vmax为1.7437μmol·min-1· mg-1。4．利用Southern blot技术分析发现，茶树基因组中的CAD1和CAD2基因均以双拷贝存在，而CAD3基因则是以单拷贝形式存在。5．茶尺蠖取食诱导3个CAD基因的表达量不尽相同，其中CAD1和CAD2间的诱导表达量的最大值差异不大，但是二者各自与CAD3的差别要明显大于CAD1和CAD2间的差异；三个基因的诱导表达量皆存在品种间差异，总体表现为舒茶早大于龙井43；从诱导表达规律上来说，三个基因也存在差异，CAD1和CAD2表达量均是随着取食后时间增加而缓慢增加，最大值分别出现在24h和9-12h之间，而CAD3是先急剧增加至最大值，紧接着急剧下降，最大值则出现在3-6h之间。而单独的机械损伤处理后，三个基因间的最大表达量差异与茶尺蠖取食诱导的类似，但是品种间差异不显著。通过外源激素诱导试验发现，茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）处理均能诱导3个CAD基因的表达上调，但是三者各自的最大表达量随着激素种类的不同而存在差异，MeJA和SA诱导CAD1和CAD2基因的最大表达量要明显高于CAD3，而ABA诱导CAD1与CAD3基因的最大表达量均明显高于CAD2基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 图表清单
• 1 文献综述
• 1.1 木质素组成及其分类
• 1.2 木质素的生物合成途径及其关键酶
• 1.2.1 苯丙烷（Phenylpropanoid）途径
• 1.2.2 木质素单体合成的特异途径
• 1.3 木质素在植物生物逆境中的作用
• 1.4 肉桂醇脱氢酶研究进展
• 1.4.1 肉桂醇脱氢酶的特征
• 1.4.2 肉桂醇脱氢酶的家族分布和分类
• 1.4.3 肉桂醇脱氢酶基因的克隆
• 1.4.4 肉桂醇脱氢酶基因的表达特征分析
• 2 引言
• 2.1 研究意义与目的
• 2.2 研究内容和技术路线
• 2.2.1 研究内容
• 2.2.2 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料与处理
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 试验处理
• 3.2 主要试剂与仪器
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器设备
• 3.2.3 实验中主要试剂配方
• 3.3 方法
• 3.3.1 处理组与对照组茶树叶片总 RNA 提取
• 3.3.2 RNA 的检测
• 3.3.3 PCR 扩增产物的纯化回收和克隆
• 3.3.4 cDNA 第一链的合成
• 3.3.5 三个 CAD 基因的 cDNA 全长克隆
• 3.3.6 CAD 基因的生物信息学分析
• 3.3.7 三个 CAD 基因的原核表达
• 3.3.8 原核表达 CAD 的纯化，包涵体复性
• 3.3.9 原核表达 CAD 的酶活检测与酶学性质研究
• 3.3.10 三个 CAD 基因的 Southern blot 分析
• 3.3.11 三个 CAD 表达特征的 qRT-PCR 分析
• 4 结果与分析
• 4.1 三个 CAD 基因的全长 CDNA克隆与序列分析
• 4.1.1 CAD 基因的 3’-RACE 克隆
• 4.1.2 CAD 基因的 5’-RACE 克隆
• 4.1.3 三个 CAD 基因的全长 cDNA 验证
• 4.1.4 三个 CAD 基因的序列分析
• 4.1.5 三个茶树 CAD 的序列同源比对和进化树分析
• 4.2 三个 CAD 基因的原核表达和蛋白纯化
• 4.2.1 CAD 基因的 ORF 扩增
• 4.2.2 重组表达载体的双酶切验证
• 4.2.3 三个 CAD 基因的原核表达和纯化
• 4.2.4 CAD2 上清中表达蛋白的条件优化
• 4.3 三个原核表达的 CAD 酶活检测和酶学性质研究
• 4.3.1 酶活检测
• 4.3.2 原核表达的 CAD2 酶学性质研究
• 4.4 三个 CAD 基因的 Southern blot 分析
• 4.5 三个 CAD 基因的表达特征分析
• 4.5.1 实时荧光定量 PCR 标准曲线的确定
• 4.5.2 茶尺蠖取食诱导三个 CAD 基因的表达特征分析
• 4.5.3 机械损伤诱导 CAD 基因的表达特征
• 4.5.4 MeJA、SA、ABA 处理对三个 CAD 基因表达的影响
• 5 讨论
• 5.1 茶树 CAD 的结构特征，进化分类和 Southern blot 分析
• 5.2 原核表达，条件优化和蛋白纯化
• 5.3 包涵体复性和酶活测定
• 5.4 CAD 基因的表达特征分析
• 6 结论
• 参考文献
• 附录A 英文缩写词汇表
• 致谢
• 作者简介