5种转基因猪、牛、山羊外源核酸快速、简便、准确检测方法的建立

论文摘要

转基因动物是当今社会的一个热门话题,由于其市场化的不可避免,如何对转基因动物及其产品进行安全管理就显得尤为重要。而检测是安全管理中十分重要的一个环节,用于转基因动物及其产品的检测方法主要是从外源基因的核酸和蛋白质两个水平进行检测,相比蛋白水平的检测,核酸水平的检测操作更为简单,因此,建立转基因生物核酸水平快速、简便、准确的检测方法具有重要意义。环介导的等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）作为一种新型的核酸扩增技术,针对靶序列上的6个区域设计4条特异性引物,在恒温条件下完成扩增,有着操作简单、快速、特异性高等特点,因此选择该方法建立转基因动物核酸水平快速、简便、准确的检测方法。本研究中取得了如下结果：1.分别优化了针对转人溶菌酶基因（LYZ）转基因牛、转人乳铁蛋白基因（LTF）转基因牛、转人乳清蛋白基因（LALBA）转基因牛、转线虫脂肪酸去饱和酶基因（FAT1）转基因猪、转乙肝表面抗原（HBsAg）转基因山羊中外源基因的LAMP扩增方法的条件并确定了扩增程序。2.建立了LAMP产物可视化检测方法,不需要电泳即可判断扩增产物的有无。3.对LAMP扩增LYZ, LTF, LALBA, FAT1 HBsAg五个基因的产物分别进行了分析酶切鉴定。4.对LAMP检测方法和PCR检测方法检测转入目的基因的检出限进行比较,实验中LAMP扩增LYZ, LTF, LALBA, FAT1、HBsAg的灵敏度分别是PCR方法的100倍、10倍、100倍、100倍、10倍。5.使用LAMP方法对已有的转LYZ基因转基因牛、转LTF基因转基因牛、转LALBA基因转基因牛、转FAT1基因转基因猪及转HBsAg基因转基因山羊进行了检测,实验中检出率均为100%。本研究得到的结论：1.本研究成功的建立了针对5种转基因猪、牛、山羊外源核酸的快速、简便、准确的检测方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 研究问题的由来
• 1.2 转基因动物研究进展
• 1.3 转基因动物的应用
• 1.3.1 基础生物学研究
• 1.3.2 器官移植的供体和人类疾病的遗传模型
• 1.3.3 生物反应器
• 1.3.4 改良和培育动物新品种
• 1.4 转基因动物及其产品检测的必要性
• 1.5 当前转基因动物检测方法
• 1.5.1 核酸水平的检测
• 1.5.2 蛋白水平的检测
• 1.6 环介导等温扩增（LAMP）技术
• 1.6.1 环介导等温扩增技术概述
• 1.6.2 环介导等温扩增技术特点
• 1.6.3 环介导等温扩增技术的引物设计
• 1.6.4 环介导等温扩增技术的基本原理
• 1.6.5 环介导等温扩增技术扩增产物的检测方法
• 1.6.6 环介导等温扩增技术的应用
• 1.6.7 环介导等温扩增技术快速、准确检测转基因动物外源核酸的依据
• 1.7 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 菌株及载体
• 2.1.3 主要分子生物学软件及数据库
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 血液及组织DNA提取
• 2.2.2 PCR反应引物设计
• 2.2.3 引物合成及测序服务
• 2.2.4 PCR扩增条件
• 2.2.5 pMD18T-LTF、pMD18T-LALBA、pMD18T-LYZ、pMD18T-FAT1、pMD18T-HBsAg载体的构建
• 2.2.6 LAMP扩增引物设计
• 2.2.7 LAMP检测条件的优化
• 2.2.8 LAMP引物特异性检测
• 2.2.9 LAMP产物分析
• 2.2.10 LAMP检出限试验
• 2.2.11 LAMP检出率实验
• 3 结果
• 3.1 LAMP反应条件的优化
• 3.1.1 LYZ基因反应条件的优化
• 3.1.2 LTF基因反应条件的优化结果
• 3.1.3 LALBA基因反应条件的优化结果
• 3.1.4 FAT1基因反应条件的优化结果
• 3.1.5 HBsAg基因反应条件的优化结果
• 3.2 LAMP引物特异性检测
• 3.2.1 LYZ基因引物特异性检测
• 3.2.2 LTF基因引物特异性检测
• 3.2.3 LALBA基因引物特异性检测
• 3.2.4 FAT1基因引物特异性检测
• 3.2.5 HBsAg基因引物特异性检测
• 3.3 LAMP扩增产物酶切验证
• 3.3.1 LYZ基因LAMP扩增产物酶切验证
• 3.3.2 LTF基因LAMP扩增产物酶切验证
• 3.3.3 LALBA基因LAMP扩增产物酶切验证
• 3.3.4 FAT1基因LAMP扩增产物酶切验证
• 3.3.5 HBsAg基因LAMP扩增产物酶切验证
• 3.4 LAMP检出限实验
• 3.4.1 LYZ基因检出限实验
• 3.4.2 LTF基因检出限实验
• 3.4.3 LALBA基因检出限实验
• 3.4.4 FAT1基因检出限实验
• 3.4.5 HBsAg基因检出限实验
• 3.5 LAMP检出率实验
• 3.5.1 LYZ基因检出率实验
• 3.5.2 LTF基因检出率实验
• 3.5.3 LALBA基因检出率实验
• 3.5.4 FAT1基因检出率实验
• 3.5.5 HBsAg基因检出率实验
• 4 讨论
• 4.1 关于LAMP技术的讨论
• 4.1.1 关于LAMP引物设计
• 4.1.2 关于LAMP的条件优化
• 4.2 关于LAMP产物的酶切验证
• 4.3 LAMP技术检测方法的优缺点
• 5 小结
• 5.1 本研究获得的结果与结论
• 5.2 本研究的创新点
• 5.3 本研究的不足之处及下一步工作计划
• 参考文献
• 在读期间发表和待发表的论文
• 致谢