利用cDNA/EST序列大规模开发内含子多态性标记的研究

论文摘要

随着大规模植物功能基因组测序项目的进展,产生了大量的表达序列标签（EST）序列。内含子广泛分布于真核生物基因组中,其变异程度通常比编码序列高得多。利用内含子上的多态性,包括内含子长度多态性（ILP）和内含子单核苷酸多态性（ISNP）,可开发成分子标记,称为内含子多态性（IP）标记。内含子在基因中的位置在物种间相对保守,因此通过将某个植物的EST序列与模式植物水稻或拟南芥的同源基因进行比较,可以推断该植物EST上的内含子位置（即相邻外显子之间的连接点）。在所推测的内含子位置两侧的EST序列上设计一对引物,就能够在该植物的基因组中扩增出包含所预测的内含子的片段并检测到该内含子中存在的多态性,从而开发出IP标记。也就是说,这样的引物具有开发出IP标记的潜力,因此我们称之为潜在的内含子多态性（PIP）标记。基于上述原理,本研究进行了大规模的PIP标记开发,构建了PIP数据库,并在棉花中进行了ILP标记的开发和应用,同时对ISNP的检测方法进行了探讨。主要结果如下:1、在59个物种中开发了57,658个PIP标记。2、建立了一个基于互联网的PIP标记数据库（http://ibi.Zju.edu.cn/pgl/pip）。该数据库提供以下功能:1)介绍PIP标记开发的流程和方法;2)查询或下载PIP标记;3)对用户提交的cDNA/EST序列进行PIP引物的在线设计;4)比较不同物种间的PIP标记的同源性。3、对PIP标记的电子PCR分析表明,根据模式植物拟南芥对苜蓿及白杨内含子的预测的准确率分别达到99.40%和98.71%,说明内含子位置确实非常保守。4、对模式植物基于自身开发的PIP标记的比较分析显示,水稻两个亚种（粳稻品种日本晴和籼稻品种93-11）之间及拟南芥两个生态型（Columbia和Landsberg）之间ILP频率分别为17.98%和18.61%,ISNP频率分别为51-22%和53.18%,说明植物中内含子多态性水平是非常高的,能够满足实际应用的需要。5、合成了220对棉花PIP标记引物,对19个栽培棉和25个野生棉材料进行PCR分析,发现92.27%的引物能得到预期的扩增产物,65.02%获得单一条带,94.09%的扩增产物包含内含子。在栽培棉（包括陆地棉和海岛棉）中ILP频率仅为3.18%,但野生棉中达到47.78%,ILP标记的PIC值变化在0.061-0.721之间,平均为0.34。6、用开发的棉花ILP标记对25个野生棉种进行聚类分析,发现ILP标记能严格区分出A、B、C、D、E、F和G七种染色体组以及二倍体和四倍体,说明ILP标记可以有效地应用于棉花分类和进化的研究。7、对利用TILLING原理检测ISNP进行了探索,并在技术上进行了简化（称为simTILLING）,提出了在分离群体中应用simTILLING技术检测ISNP标记的原理。8、对利用引物长度差异的PCR检测SNP的方法进行了尝试。利用该方法在棉花中开发了6个EST-SNP标记。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 文献综述
• 1 几个主要分子标记的原理与特点
• 1.1 RFLP
• 1.2 RAPD
• 1.3 AFLP
• 1.4 SSR
• 1.5 SNP
• 2 内含子的特点及相关分子标记
• 2.1 内含子的分类
• 2.2 内含子的功能研究
• 2.3 内含子长度与密度
• 2.4 内含子位置的保守性
• 2.5 内含子相关标记
• 3 EST分子标记开发
• 3.1 EST分子标记的类型及特点
• 3.2 EST标记的开发策略
• 第一章 潜在内含子多态性标记的开发
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 序列数据来源
• 1.1.2 PIP标记开发的原理
• 1.1.3 开发PIP标记的方法
• 1.1.4 PIP标记的命名
• 1.1.5 PIP标记的批量设计开发环境
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 开发的PIP标记
• 1.2.2 PIP标记数据库
• 1.2.3 PIP标记的可靠性和实用性
• 1.3 讨论
• 1.3.1 PIP标记在比较基因组学研究中的应用价值
• 1.3.2 内含子长度的相关性分析
• 1.3.3 PIP标记数据库的更新和应用前景
• 第二章 内含子长度多态性标记的开发和应用
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 棉花材料
• 2.1.2 DNA的提取
• 2.1.3 棉花PIP标记的筛选与引物合成
• 2.1.4 PCR扩增和电泳检测
• 2.1.5 ILP标记多态性水平的评价
• 2.1.6 棉属系统发生树的构建
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 棉花PIP标记的扩增情况
• 2.2.2 棉花中的ILP水平
• 2.2.3 棉属的系统发生树
• 2.3 讨论
• 2.3.1 ILP标记的评价
• 2.3.2 ILP标记的应用
• 2.3.3 ILP标记的局限性
• 第三章 内含子单核苷酸多态性检测方法的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 DNA的提取、PCR扩增和电泳
• 3.1.3 对未知SNP的检测（简化TILLING法）
• 3.1.4 对已知SNP的检测（引物长度差别PCR法）
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 simTILLING的结果与分析
• 3.2.2 sPLD-PCR的结果与分析
• 3.2.3 mPLD-PCR的结果与分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 PCR试验所需杂种DNA的获得
• 3.3.2 CEL Ⅰ酶切在ISNP标记开发中的应用
• 3.3.3 用CEL Ⅰ酶切法大规模检测ISNP的可能性
• 3.3.4 EST-SNP标记的优点
• 3.3.5 EST-SNP标记的局限性
• 3.3.6 ISNP标记的应用前景
• 参考文献
• 附表1 PIP标记数据库中的物种及标记个数信息表
• 附表2 合成的棉花PIP标记列表
• 附录1 所用栽培棉花材料介绍
• 附录2 改良的棉花基因组DNA的提取、分离和纯化
• 附录3 Tag酶的提取方法
• 附录4 非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳的方法
• 附录5 CEL Ⅰ酶的提取
• 附录6 CEL Ⅰ酶切
• 致谢