玉米C型胞质雄性不育恢复相关基因的克隆

论文摘要

细胞质雄性不育的利用是实现杂种优势的一条重要途径。玉米（Zea mays L.）是世界上最早利用雄性不育进行杂交种子生产的作物,在降低生产成本、提高种子纯度等方面起到了积极的作用。目前在玉米种子生产上主要利用C型胞质雄性不育,然而玉米C型胞质雄性不育的恢复机理比较复杂,其恢复机理目前还不十分清楚,在一定程度上制约了其在生产上的利用。本研究利用转座子标签法对玉米C型胞质雄性不育的育性恢复相关基因进行克隆,并对候选基因的功能进行初步分析,取得了以下主要结论:利用Mu转座子插入突变的方法,从29750株Cms-C87-1（Rf4Rf4）×Mu7的F1群体中筛选到5株雄性不育的插入突变体Rf4-m,并对其进行了不育细胞质鉴定,证明该突变是由核基因引起的。利用改良的AFLP方法对Cms-C87-1（Rf4Rf4）、Mu7和突变体Rf4-m进行多态性分析。在引物组合M1/BglⅡ-2的选择性扩增结果中,发现了一个750bp不同于两亲本的特异扩增片段。把特异的扩增片段连接转化测序,获得的序列中包含Mu转座子的部分序列和一段未知序列,推测可能是候选基因的部分序列。根据候选基因的侧翼序列设计引物,利用3’RACE快速扩增技术,以玉米雄穗的小花分化期的cDNA为模板,获得了一个209bp的cDNA序列。利用生物信息学的方法对候选基因序列进行延伸,获得了一个全长为955bp的cDNA序列,基因组序列分析结果表明其DNA全长2625bp,包含3个内含子和4个外显子,其中有一个321bp的开放阅读框,编码106个氨基酸,功能结构域分析表明该基因是一个基本转录因子TFIIA。该基因与水稻、拟南芥等生物体的TFIIA基因有很高的相似性,同时与水稻的TFIIA基因有很近的同源关系。TFIIA转录因子是一个核内蛋白,它参与了依赖于RNA聚合酶Ⅱ的DNA的转录。TFIIA是基本转录因子之一,这些基本转录因子是所有依赖于RNA聚合酶Ⅱ的转录所必需的。已有研究表明,动物中的TFIIA影响环磷酸腺苷应答元件调节器（CREM）,而CREM基因编码的蛋白在雄性生殖细胞的发育过程中起着重要作用。TFIIA通过对关键基因CREM的调控,间接的调控精雄性生殖细胞的成熟发育。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 高等植物雄性不育
• 1.1.1 雄性不育的分类
• 1.1.2 玉米雄性不育的研究进展
• 1.1.2.1 细胞核雄性不育（Genic Male Sterility GMS）
• 1.1.2.2 细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterility,CMS）
• 1.1.2.3 核-质互作型雄性不育（Genic-cytoplasmic Male Sterility）
• 1.1.3 玉米细胞质雄性不育
• 1.1.3.1 玉米细胞质雄性不育的分类方法
• 1.1.3.2 不同细胞质雄性不育系的特点
• 1.1.3.3 玉米细胞质雄性不育恢复机理研究进展
• 1.1.3.4 玉米细胞质雄性不育的相关基因及其功能
• 1.1.4 细胞质雄性不育和育性恢复的机理
• 1.1.4.1 植物CMS 基因引起雄性不育的原因
• 1.1.4.2 育性相关核基因的克隆及雄性不育性恢复机理的假说
• 1.2 AFLP 的标记
• 1.2.1 AFLP 标记的基本原理
• 1.2.2 AFLP 试验过程包括三个步骤
• 1.2.3 改良的AFLP 技术
• 1.2.4 AFLP 技术特点
• 1.2.5 AFLP 标记在遗传学方面的应用
• 1.2.5.1 遗传多态性研究方面
• 1.2.5.2 在个体分型、遗传分析方面
• 1.2.5.3 在育种应用方面
• 1.3 基因克隆
• 1.3.1 转座子标签法
• 1.3.1.1 转座子的概念
• 1.3.1.2 转座子的分类
• 1.3.1.3 玉米中的转座子及其特点
• 1.3.1.4 利用转座子标签克隆的基因
• 1.3.2 RACE 方法
• 1.3.2.1 RACE 技术的原理
• 1.3.2.2 RACE 在植物基因克隆上的应用现状
• 1.3.2.3 RACE 方法在植物基因克隆上的技术优势
• 1.3.3 “电子”cDNA 文库筛选--一种新的克隆cDNA 全长的技术
• 1.3.4 图位克隆法（mapbased cloning）
• 1.3.5 计算机杂交（computer hybridization）
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.2 Mu7 转座子基因型的确定
• 3.3 玉米C 型胞质雄性不育恢复相关基因突变体的筛选
• 3.4 高质量DNA 的提取和纯化
• 3.4.1 采用改良的SDS 方法提取亲本及突变的基因组DNA
• 3.4.2 DNA 的纯化及质量检测
• 3.5 改良的AFLP 的基本反应程序
• 3.5.1.限制性内切酶酶切
• 3.5.2 酶切产物和结头引物连接
• 3.5.2.1 连接反应的接头序列
• 3.5.2.2 接头的制备和连接反应
• 3.5.3 预扩增和选择性扩增的体系及PCR 反应的程序
• 3.5.3.1 预扩增的引物和体系
• 3.5.3.2 选择性扩增的体系和PCR 反应程序
• 3.5.4 选择性扩增产物检测
• 3.5.4.1 扩增DNA 变性
• 3.5.4.2 电泳准备
• 3.5.4.3 扩增产物的电泳
• 3.5.4.4 扩增产物的银染检测——聚丙烯酰胺凝胶 NaOH 染色方法
• 3.6 差异片段的回收和测序
• 3.6.1 差异片段的回收
• 3.6.2 差异片段的测序
• 3.6.2.1 差异DNA 片段与pGEM-T 载体的连接
• 3.6.2.2 电转化和转化子的筛选与鉴定
• 3.7 RACE 方法获得候选基因部分片段
• 3.7.1 总RNA 的抽提
• 3.7.1.1 实验前的准备
• 3.7.1.2 所需试验试剂
• 3.7.1.3 抽提RNA
• 3.7.1.4 RNA 含量和质量的检测
• 3.8 3’RACE 对cDNA 进行序列扩增
• 3.8.1 引物的设计
• 3.8.2 cDNA 第一链的合成
• 3.8.3 cDNA 第二链的合成
• 3.8.4 PCR 产物的纯化
• 3.8.5 PCR 产物的测序
• 3.8.5.1 连接
• 3.8.5.2 转化子的筛选与鉴定
• 4 结果与分析
• 4.1 恢复相关基因突变体侧翼序列的克隆
• 4.1.1 恢复相关基因突变体的筛选
• 4.1.2 玉米 C 型胞质育性恢复相关基因插入突变体的胞质类型的鉴定
• 4.1.3 Cms-C87-1、Mu7、突变体材料中的Mu7 序列扩增
• 4.1.4 育性恢复突变体侧翼片段扩增
• 4.1.4.1 模板DNA 质量的检测
• 4.1.4.2 基因组DNA 的酶切检测
• 4.1.4.3 DNA 片段的选择性扩增
• 4.1.4.4 Mu-AFLP 选择性扩增电泳检测
• 4.1.4.5 差异片段的回收和序列分析
• 4.2 候选基因cDNA 的3’RACE 扩增
• 4.2.1 RNA 的检测和RT-PCR 产物检测
• 4.2.2 3’RACE 扩增
• 4.2.3 3’RACE 的测序结果
• 4.3 候选基因的生物信息学分析
• 4.3.1 候选基因序列的电子延伸
• 4.3.2 候选基因的克隆分析
• 4.3.3 候选基因中开放阅读框的查找
• 4.3.4 候选基因编码蛋白的分子量和等电点分析
• 4.3.5 蛋白质的结构功能域的预测
• 4.3.6 候选基因和几种植物同源序列的氨基酸的比较
• 4.3.7 系统发生树的构建
• 4.4 侯选基因恢复系和不育系中侯选基因的DNA 序列分析
• 5 结论和讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.2.1 在Mu-AFLP 试验中可能存在的问题
• 5.2.2 选取玉米小花分化时期提取RNA 的原因
• 5.2.3 玉米C 型胞质雄性不育与转录因子TFIIA 的关系
• 参考文献
• ABSTRACT