蛋白质组学方法识别RKIP作为鼻咽癌的转移抑制蛋白

论文摘要

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方地区（广东、广西、湖南、福建、江西）常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居世界首位,是一种中国特色癌,严重危害国人的生命和健康。NPC几乎均为低分化鳞癌和未分化癌,恶性程度高,易早期发生颈部淋巴结和远处转移,而且NPC放疗后局部残灶复发、远处转移亦是制约其疗效和预后的瓶颈。因此,转移是NPC患者死亡的主要原因,但NPC转移的分子机制至今仍然不清楚,发现NPC转移相关分子对于揭示NPC转移机制、指导NPC治疗、改善NPC预后具有十分重要的作用。高通量的组学技术是发现肿瘤相关分子的重要手段。如cDNA芯片分析NPC的基因表达谱已发现一些与NPC发病有关的异常表达基因。蛋白质是细胞的功能分子,因此,蛋白质组学技术在识别肿瘤发生发展相关蛋白质、发现肿瘤分子标志物和治疗靶标方面具有独特的优势。为筛选NPC发病相关的蛋白质,本研究开展了如下3个方面的研究工作:1、NPC组织与癌旁正常鼻咽上皮组织（adjacent normal nasopharyngealepithelial tissue,ANNET）的差异蛋白质组学研究:以10例配对的NPC组织和ANNET为样本,采用二维凝胶电泳（two-dimensional gelelectrophoresis,2-DE）技术分离组织的总蛋白质,图像分析识别NPC组织和ANNET差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离-四极杆-串联质谱（ESI-Q-TOF MS/MS）鉴定差异表达的蛋白质。结果共鉴定了21个差异蛋白质,其中Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein,RKIP）等9个蛋白质在NPC组织中的表达水平显著低于ANNET。2、NPC组织与正常鼻咽上皮组织（normal nasopharyngeal epithelialtissue,NNET）的差异磷酸化蛋白质组学研究:以10例NPC组织和10例NNET为样本,采用2-DE分离组织的总蛋白质,蛋白质转膜后与抗酪氨酸磷酸化抗体进行2D Western blotting分析,图像分析识别差异磷酸化蛋白质点,ESI-Q-TOF MS/MS鉴定差异酪氨酸磷酸化蛋白质,采用NetPhos软件预测蛋白质的酪氨酸磷酸化位点,采用1-D Westernblotting对差异磷酸化蛋白质RKIP进行验证。结果共鉴定了13个差异酪氨酸磷酸化蛋白质,其中RKIP等6个蛋白质在NPC组织中的磷酸化水平显著低于NNET。3、RKIP在NPC转移中的作用和机制研究:为探讨RKIP在NPC转移中的作用和机制,采用Western blotting检测RKIP在不同转移潜能的5-8F和6-10B NPC细胞中的表达水平;采用免疫组化方法检察RKIP在石蜡包埋NPC组织、NNET及颈淋巴结转移NPC组织（lymphnode metastaticNPC,LMNPC）中的表达水平;采用脂质体转染方法将正义、反义RKIP表达质粒及其相应空白载体分别转染5-8F和6-10B细胞,建立相应的稳定转染细胞系,分析RKIP表达水平改变对NPC细胞体外侵袭能力以及Raf-1/MEK/ERK和NF-κB信号通路活性的影响。结果显示:RKIP在高转移5-8F细胞中的表达水平低于非转移6-10B细胞、在NPC组织中的表达水平低于NNET、在LMNPC中表达缺失。上调RKIP表达能抑制5-8F细胞的体外侵袭能力,而下调RKIP表达能增强6-10B细胞的体外侵袭能力;上调RKIP表达能降低5-8F细胞Raf-1/MEK/ERK和NF-κB信号通路活性,而下调RKIP表达能增强6-10B细胞Raf-1/MEK/ERK和NF-κB信号通路活性。研究结果表明,RKIP可能是NPC的转移抑制蛋白,RKIP表达下调/缺失可能通过活化化Raf-1/MEK/ERK和NF-κB信号通路促进NPC转移,本研究初步揭示了RKIP在NPC侵袭和转移中的作用和机制,为RKIP作为防治NPC转移的靶标提供了实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写词简表
• 第一章 鼻咽癌组织与癌旁正常鼻咽上皮组织的差异蛋白质组学研究
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 参考文献
• 第二章 鼻咽癌组织与正常鼻咽上皮组织的差异磷酸化蛋白质组研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 参考文献
• 第三章 RKIP蛋白在鼻咽癌转移中的作用和机制
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果