论文题目: 大鼠DRG神经元上G蛋白介导的受体内吞研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 神经生物学
作者: 王烈成
导师: 周专
关键词: 胞吞,胞吐,蛋白耦联受体,配体受体结合,膜电容,共聚焦,荧光,背根神经节,受体内吞,颈上神经节,型乙酰胆碱受体,型乙酰胆碱受体,抑制,蛋白激酶,蛋白激酶
文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
发表年度: 2005
论文摘要: 胞吞(endocytosis)是紧接着胞吐(exocytosis)后细胞膜恢复的一项重要生理功能。目前,去极化引起的胞吐所需时间的研究比较清楚,而配体引起的胞吞所需时间的研究甚少。配体-受体结合(ligand-receptorbinding, LRB)是细胞信号转导的初始步骤。细胞膜上的大部分受体包括G蛋白耦联受体(GPCR)和酪氨酸受体(receptor tyrosine kinase, RTK)与配体的结合不能产生膜电流或引起胞内[Ca2+]升高,所以很难研究这类LRB的动力学效应。为了解决这个问题,本文发展了一整套实时记录单个活细胞上配体-受体结合引起的胞吞的技术。这套技术包括(1)膜片钳测量细胞膜电容(Cm);(2)共聚焦FM成像技术—具有高空间分辨率和高灵敏度;(3)连续时间扫描的共聚焦FM成像技术;(4)可分辨囊泡年龄的共聚焦FM成像技术。应用这些新发展的技术,我们发现在急性分离的DRG神经元上ADP-P2Y受体内吞所需的时间是1.7 s,这比用传统生化方法的估测的时间精度(< 2分钟)提高了两个数量级。另外,本研究还发现配体引起胞吞的囊泡和去极化引起胞吞的囊泡在胞内有着截然不同的分布方式。刺激3分钟后,ADP引起胞吞的囊泡均匀分布在胞浆内,而去极化引起胞吞的囊泡集中分布在细胞膜周边区域。ADP引起的胞吞和去极化引起的胞吞都需要胞体内dynein的参与。另外,神经生长因子(NGF)与TrKA(一种酪氨酸受体)结合也引起快速的胞吞。本文发展的实时检测LRB-胞吞技术,为针对GPCR的药物筛选提供了一种高速、高敏感和高通量的技术手段。GPCR内吞是其信号转导的初始反应,本实验室以往的研究发现在大鼠SCG神经元上存在乙酰胆碱的M型受体(mAChRs)对乙酰胆碱的N型受体(nAChRs)介导的电流有明显的阻抑作用,即“M-抑制”。在此基础上,我进一步研究这种M-抑制的作用机制。用去甲肾上腺素和bradykinin能够模拟类似的M-抑制效应,而用somatostatin不能模拟这种M-抑制效应,这说明M-抑制效应是通过某种GPCR途径来实现的。U73122(PLC抑制剂)能够部分阻断M-抑制;phorbol myristoyl acetate(PKC激动剂)能够
论文目录:
摘要
Abstract
图表目录
英文缩写一览表
第一部分 大鼠DRG神经元G蛋白耦联受体的胞吞时空特性
1. 引言
2. 材料和方法
2.1 大鼠背根神经节(DRG)神经元的急性分离
2.2 全细胞膜片钳记录
2.3 P2Y1 DNA 和 Nudel 结构
2.4 细胞转染
2.5 细胞内钙离子测量方法
2.6 单个囊泡和单个细胞荧光检测
2.7 试剂
2.8 数据分析和统计学处理
3. 实验结果
3.1 应用膜电容测量 ADP 引起 DRG 神经元膜胞吞
3.2 ADP 引起细胞膜电容变化的剂量依赖性和时间相关性
3.3 ADP 引起胞吞的动力学效应
3.4 FM荧光成像检测ADP引起的胞吞
3.5 FM 荧光成像实时检测(FII)单个囊泡胞吞
3.6 Ca~(2+)对 ADP 引起胞吞的影响
3.6.1 ADP 引起的胞吞不需要细胞内钙明显的升高
3.6.2 ADP 引起的胞吞不需要细胞外钙的参与
3.7 Suramin 能够可逆的阻断ATP 引起的胞吞
3.8 阻断蛋白质磷酸化能够阻断 ATP 引起的胞吞
3.9 ADP 引起的胞吞是由clathrin 介导的
3.10 dynamin 不参与 ADP 引起的胞吞
3.10.1 dynamin.1不能阻抑ADP引起的胞吞
3.10.2 dynamin.2也不能阻抑ADP引起的胞吞
3.11 ADP引起的胞吞是P2Y1受体内吞
3.12 5.HT在DRG神经元上也引起胞吞
3.13 NGF在DRG神经元上也引起胞吞
3.14 在 HEK293 细胞上观察配体刺激引起的胞吞
3.15 ADP 和高K~+刺激引起的胞吞在胞内分布明显不同
3.16 GPCR 和TRK 引起胞吞囊泡/FM 荧光亮点的不同特性
3.17 神经元胞体中 Dynein 逆行运输蛋白是 ADP 引起的胞吞过程所必需的
4. 讨论
5. 结论
6. 参考文献
第二部分:胆碱能 M 型受体对 N 型受体的调控机制
1. 引言
2. 材料和方法
2.1 大鼠颈上神经节(SCG)神经元的急性分离
2.2 全细胞膜片钳记录
2.3 细胞内钙离子测量方法
2.4 电化学炭纤微电极记录
2.5 试剂
2.6 数据分析和统计学处理
3. 实验结果
3.1 去甲肾上腺素、Bradykinin 和somatostatin 对尼古丁电流的影响
3.2 MCh 对 SCG 神经元分泌和细胞内钙离子的影响
3.3 PKC 途径
3.3.1 抑制胞内 PLC 水平,对 M.抑制的影响
3.3.2 PKC 水平对M.抑制的影响
3.4 PKA水平对M.抑制的影响
3.5 联合PKC 和PKA 对 M.抑制的影响
3.6 M 型胆碱能受体对 N 型胆碱能受体引起分泌效应的抑制
4. 讨论
5. 结论
6. 参考文献
读博期间已发表和待发表的论文
文献综述:蛋白酶激活受体:调节G 蛋白耦联受体信号和转导通路
致谢
发布时间: 2006-08-29
参考文献
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