基质细胞衍生因子-1a对外周血内皮祖细胞的影响及其机制探讨

论文摘要

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型,也未形成血管的前体细胞。研究发现,EPCs不仅参与血管形成（angiogenesis）,同时也参与出生后血管生成（vasculogenesis）。近来研究表明内皮功能障碍在冠心病的发生、发展中扮演了重要角色。内皮功能障碍的本质是内皮损伤和修复之间动态平衡的破坏,而EPCs在内皮损伤后的修复中起重要作用。EPCs能修复损伤的内皮细胞,保持内膜完整性从而抑制局部粥样硬化斑块及血栓的形成。然而诸如老龄化、糖尿病、高血压、高胆固醇及吸烟等冠心病危险因素对循环EPCs数量和活性具有明显抑制作用。基质细胞衍生因子-1a（Stromal cell-derived factor-1a,SDF-1a）是趋化因子CXC亚家族中的一员,首先在小鼠骨髓基质细胞分泌的细胞因子中被发现,又被称为B细胞生长因子。其受体（CXCR4）是一个有7个跨膜结构域的G蛋白耦联受体。近来研究表明SDF-1a/CXCR4之间的特异性作用在调节干细胞的功能,如迁移、增殖、动员及血管形成的过程中起重要的作用。基于上述理论,我们提出假设:SDF-1a可以影响EPCs的数量和功能,继而影响内皮修复能力,维持内皮损伤和修复之间的动态平衡,促进内皮功能的恢复,进而延缓动脉粥样硬化的发生、发展。目前国内外有关SDF-1a对EPCs数量和功能的影响,特别是对其机制的研究尚很少。为此,我们首先观察了SDF-1a体外干预对外周血EPCs数量和功能的影响,随后进一步探讨了SDF-1a影响EPCs数量和功能的可能机制。以下分三部分对本研究的方法、结果以及结论作一简述。第一部分基质细胞衍生因子-1a对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响目的:观察SDF-1a体外干预对外周血EPCs数量和功能的影响。方法:采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,培养7d后,收集贴壁细胞,加入不同浓度SDF-1a（1ngl/mL,10ngl/mL,50ngl/mL和100ngl/mL）干预,观察量效关系。多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPCs。采用MTT比色法、改良的Boyden小室和粘附能力测定实验分别观察EPCs的增殖能力、迁移能力和粘附能力。结果:SDF-1a能显著增加外周血EPCs数量,并且EPCs数量随SDF-1a浓度增高而增加。此外,SDF-1a能明显增加EPCs的增殖、迁移和粘附能力,并呈浓度依赖性,在100ng/ml组（与对照组比较,增殖能力0.37±0.06 vs 0.23±0.03,迁移能力102.0±22.5 vs 21.5±6.2,粘附能力95.7±21.0 vs 32.2±8.3）达最大增加效应。结论:SDF-1a可增加EPCs数量并增强EPCs功能,且SDF-1a对EPCs的影响呈一定的量效关系。第二部分基质细胞衍生因子-1a影响内皮祖细胞机制的探讨之一——抑制内皮祖细胞凋亡目的:研究SDF-1a对去血清诱导EPCs凋亡的影响及其信号转导途径。方法:采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,培养4d后,收集贴壁细胞,多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPCs。免疫磁珠筛选CD34+细胞。RT-PCR检测SDF-1a受体CXCR4 mRNA的表达;流式细胞仪测定CXCR4表达率。培养7d后的EPCs进行去血清培养48h以诱导EPCs凋亡,加入不同浓度SDF-1a（1ngl/mL,10ngl/mL,50ngl/mL和100ngl/mL）干预,或先予以P13K、MAPKs、eNOS抑制剂预处理1h,然后再用100ngl/mL SDF-1a干预。FITC-Annexin V/PI流式细胞仪检测EPCs凋亡。Caspase-3 Colorimetric Assay Kit检测caspase-3活性。Western blot检测EPCs Akt Ser473、ERK1/2、JNK、p38MAPK、eNOS Ser1177磷酸化水平及caspase-3蛋白水平。采用MTT比色法观察EPCs的增殖能力。结果:培养7天后的EPCs的SDF-1a受体CXCR4 mRNA及蛋白表达水平明显高于新分离的CD34+细胞;SDF-1a能够显著抑制去血清培养诱导的EPCs凋亡,并且此抑制作用随SDF-1a浓度的增加而增加。SDF-1a同样可以抑制caspase-3的活性及其蛋白表达。CXCR4受体阻断剂（AMD3100）,PI3K抑制剂（Wortmannin和LY294002）能近乎完全的抵消SDF-1a抑制EPCs凋亡的作用;eNOS抑制剂（LNAME）可以部分抵消SDF-1a抑制EPCs凋亡的作用;而MAPKs抑制剂（PD98059、SB203580及SP600125）则对SDF-1a抑制EPCs凋亡的作用没有明显影响。Western blot检测显示SDF-1a可以促进EPCs Akt、eNOS、ERK1/2、JNK、P38MAPK的磷酸化。此外,SDF-1a干预后伴随EPCs增殖能力的增加。结论:SDF-1a可以抑制去血清诱导的EPCs凋亡;PI3K/Akt/eNOS而非MAPKs信号途径参与SDF-1a抑制EPCs凋亡的调控。第三部分基质细胞衍生因子-1α影响内皮祖细胞机制的探讨之二——抑制内皮祖细胞衰老目的:研究SDF-1a对EPCs衰老的影响。方法:采用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,培养4d后,收集贴壁细胞。多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPCs。RT-PCR检测CXCR4及hTERT mRNA水平。采用SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测衰老细胞。端粒重复序列扩增法（telomeric repeatamplification protocol,TRAP）-ELISA定量检测端粒酶活性,TRAP—聚丙烯酞胺凝胶电泳（PAGE）—银染法定性检测端粒酶活性。MTT和集落生成能力测定实验检测EPCs的增殖能力和集落形成能力。Western blot检测EPCs Akt Ser473磷酸化水平。结果:SDF-1a能减少SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量,SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量随着SDF-1a浓度的增加而减少。SDF-1a可以促进EPCs hTERT mRNA的表达。SDF-1a增加EPCs端粒酶活性。CXCR4受体阻断剂（AMD3100）,PI3K抑制剂（LY294002）可以抑制SDF-1a对EPCs hTERT mRNA表达及端粒酶活性的促进作用。Western blot检测发现SDF-1a可以促进Akt磷酸化。此外,SDF-1a干预后可增加EPCs的增殖及集落形成能力。结论:SDF-1a延缓EPCs衰老,伴随EPCs增殖及集落形成能力的增加;SDF-1a延缓EPCs衰老可能跟EPCs端粒酶活性增加及hTERT mRNA的表达上调有关;PI3K/Akt信号转导途径可能参与SDF-1a延缓EPCs衰老的调控。

论文目录

• 主要简略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究正文
• 前言
• 第一部分 基质细胞衍生因子-1a对外周血内皮祖细胞功能的影响
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 基质细胞衍生因子-1a影响内皮祖细胞机制的探讨之一——抑制内皮祖细胞凋亡
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 基质细胞衍生因子-la影响内皮祖细胞机制的探讨之二——抑制内皮祖细胞衰老
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 参考文献
• 博士在读期间发表的主要论文
• 致谢