论文摘要
背景和目的：缺血耐受（ischemic tolerance，IT）现象是指组织经受短暂的亚致死的缺血或缺氧等处理后，在特定的时间内对再次的长时间的缺血产生耐受。短暂的亚致死性脑缺血称为脑缺血预处理（ischemic preconditioning，IPC）。缺血预处理和缺血耐受现象可以作为一种损伤性应激源，有效地调动机体组织的自身保护机制，提高组织对以后持续较长时间缺血的耐受能力，表现为组织细胞死亡、梗死范围明显缩小，器官功能障碍明显减轻。缺血耐受现象通常在缺血预处理以后数小时或一天开始诱发，持续一周或更长的时间。我们结合以往新生大鼠皮层神经细胞的培养，对取材、消化、培养环境等方面进行了控制和改进，获得了较理想的培养效果的同时建立了氧、糖剥夺预处理模型。为进一步研究脑缺血和缺血预处理的分子机制提供了实验依据。方法：体外培养大鼠皮质额、颞叶神经元，于种植第3d用神经特异性烯醇化酶（NSE）抗血清按ABC法免疫组化染色进行神经细胞鉴定，并观察神经细胞生长情况，应用台盼蓝染色计算神经元存活率。细胞培养10～14d，进行氧、糖剥夺预处理模型的建立及实验分组。先用预温的解剖液洗涤培养板两次，然后用Earle’s液置换原培养液，将培养板随机分为4组：Ⅰ对照组；Ⅱ单纯氧、糖剥夺组；Ⅲ氧、糖剥夺预处理组；Ⅳ致死性氧、糖剥夺组。应用免疫组化技术检测各组神经细胞中HSP70、c-fos、bcl-2、caspase-3蛋白的表达。应用TUNEL法、吖啶橙荧光染色检测细胞凋亡，证实氧、糖剥夺预处理能否较好的保护神经元，减少其凋亡。结果：神经元培养第三天经由神经元特异性烯醇化酶（NSE）染色进行神经细胞鉴定，结果几乎全为神经元细胞。经由台盼蓝染色可见致死性氧、糖剥夺组（Ⅳ组）较其它三组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组）比较神经细胞死亡较多（P＜0.01）。预处理组（Ⅱ、Ⅲ组）神经细胞HSP70／c-fos蛋白表达明显高于对照组（Ⅰ组）和致死性氧、糖剥夺组（Ⅳ组）（P＜0.01）；单纯氧、糖剥夺组（Ⅱ组）caspase-3／bcl-2阳性细胞数与对照组（Ⅰ组）比较无显著性差异（P＞0.01），但氧、糖剥夺预处理组（Ⅲ组）所致神经细胞bcl-2高表达，同时减少caspase-3的表达，与致死性氧、糖剥夺组（Ⅳ组）比较，差异有显著性（P＜0.01）。应用TUNEL法和吖啶橙荧光染色检测细胞凋亡，单纯氧、糖剥夺组（Ⅱ组）引起神经细胞的凋亡数，与对照组（Ⅰ组）比较无显著性差异（P＞0.01），氧-糖剥夺预处理组（Ⅲ组）与致死性氧、糖剥夺组（Ⅳ组）比较神经细胞凋亡数明显减少（P＜0.01）。结论：本实验成功建立了体外培养大鼠皮质神经元的实验模型，证实了预处理能激动引起脑缺血耐受机制，减少神经细胞凋亡，增加Hsp70、c-fos、bcl-2的表达，抑制caspase-3的表达。脑缺血预处理的神经保护机制可能是通过增加新蛋白的合成、抗神经细胞凋亡作用而实现的。