论文摘要
前言恶性肿瘤是一种全身性疾病,化疗作为配合手术的治疗方法,其致命缺点是同时杀伤人体正常细胞,造成严重的并发症。因此,化疗不能于围手术期即刻开展并持续进行,这就给了进入血液的肿瘤细胞一个喘息的时机。临床上需要发现一种没有上述缺点的配合手术治疗的新疗法。诱导分化在治疗人类急性早幼粒细胞白血病方面所取得的巨大成功,使诱导分化疗法作为配合手术治疗的新疗法成为可能。诱导分化作为恶性肿瘤的一种新型治疗方法,基本特点在于不杀伤肿瘤细胞,而是诱导肿瘤细胞分化为正常或接近正常细胞。目前研究的诱导分化剂有很多种,其中也包括低浓度的化疗药物。恶性肿瘤细胞在分化诱导剂作用下,向正常或接近正常细胞方向分化逆转,表现为形态学改变、细胞增殖能力下降和具有正常细胞的功能。在细胞周期改变中,表现为G0/G1期比例升高,G2+M期比例下降,细胞周期阻滞。细胞周期需要经历G1-S-G2-M期,它有两个重要的调控点,G1/S和G2/M。细胞周期的进程受到许多相关基因的调控,包括癌基因和抑癌基因。通过细胞周期素依赖性激酶、细胞周期素蛋白以及细胞周期素依赖性激酶抑制因子的相互作用来协调。细胞周期的失调在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用,而且通过调节细胞周期,使细胞增殖抑制,诱导肿瘤细胞分化,已成为诱导分化研究的热点。本实验采用临床上常用的化疗药物表柔比星和丝裂霉素作为研究药物,用低浓度的表柔比星、丝裂霉素处理肺腺癌细胞A549,从细胞增殖抑制、细胞周期调控、形态学、超微结构改变几个方面观察药物对肺癌细胞细胞周期阻滞作用和诱导分化作用,并通过Western Blot法于翻译水平检测基因caspase3、p21、RARα蛋白的表达;Rt-PCR法于转录水平检测基因bcl-2、cyclinD3、nm23的mRNA的表达,从分子水平分析其细胞增殖抑制的机制。实验方法1、细胞培养A549细胞接种于含10%胎牛血清、PH值7.0-7.2的RPMI1640培养液中,于37℃、5%C02培养箱中培养,反复传代、培养至实验所需数量。实验设对照组。2、MTT法细胞增殖活性测定细胞消化后以1×105/ml数量加入96孔板、每孔180μl,12小时后,处理组加药,每种药物的不同浓度设3个重复孔,各加入相应药物20μl。同时每浓度各设3孔空白对照。处理药物表柔比星、丝裂霉素浓度依不同指标对细胞要求分另0为（1）5.4μmol/L、9.3μmol/L;（2）21.6μmol/L、37.4μmol/L;（3）43.2μmol/L、74.8μmol/L;（4）172.4μmol/L、299.1μmol/L。24小时后各孔加入5.0g/L的MTT20μl,孵育4小时后吸弃上清,各加二甲基亚砜（DMSO）100μl,震荡后用酶联检测仪于570nm波长处读取各孔吸光度OD值（opticaldensity）,并计算每种药物不同浓度的增殖抑制率。实验重复3次。肿瘤细胞增殖抑制率=（对照孔平均OD值-实验孔平均OD值）/对照孔平均OD值×100%3、流式细胞仪检测细胞周期变化细胞消化后以2×105/ml数量加入6孔板,每孔2.7ml,12小时后,处理组加药,本指标的细胞选取的表柔比星、丝裂霉素浓度分别为5.4μmol/L、9.3μmol/L与172.4μmol/L、299.1μmol/L。各加入相应药物0.3ml,以检测药物浓度高低对细胞的影响。同时对照加0.3ml培养液。24小时后收集上清液后消化、离心收集细胞、PBS冲洗、70%冷乙醇固定、0-4℃保存。检测前离心去乙醇,PBS冲洗,用碘化丙啶（PI）避光染30分钟,以流式细胞仪FACSCalibur,BD（美国）于FLA-2参数下检测细胞周期,采集软件Cell Quest3.0采样,分析软件ModFitLT3.0定量分析细胞周期各时期的百分率及凋亡、坏死细胞的百分率。实验重复3次。4、细胞的形态学检测（1）倒置显微镜下观察细胞形态变化。（2）Giemsa染色观察细胞形态变化:处理后的细胞用甲醇固定10分钟、Giemsa染液染色15分钟、冲洗、95%乙醇及无水乙醇脱水、二甲苯透明,中性树胶封片后于400倍光镜下观察。（3）吖啶橙荧光染色观察细胞形态变化:处理后的细胞用95%乙醇固定,1%醋酸酸化,0.01%吖啶橙染液染色,0.1mol/LCaCl2分化,PBS封片,避光冷藏状况下于荧光显微镜下观察并照相。（4）罗丹明123荧光染色观察细胞线粒体改变:将处理后的细胞用PBS冲洗,于罗丹明123标记液中37℃温育15分钟、吸去标记液、PBS冲洗细胞玻片3次、固定盖玻片。避光冷藏状况下于荧光显微镜下观察并照相。（5）电子显微镜观察细胞超微结构的改变:细胞用2.5%冷戊二醛、1.0%锇酸双固定,梯度乙醇和丙酮脱水,Epon812树脂包埋,超薄切片机（AO型）切片至500-700（?）,醋酸钠和柠檬酸铅双重染色,H-600A型透射电镜下观察并拍照。5、免疫组织化学法检测Rb的表达药物处理后的A549细胞用冷丙酮固定20min,PBS冲洗,滴加Rb一抗及二抗,显色,苏木素复染,酒精梯度脱水,二甲苯透明,封片。显微镜下观察,照相。应用专业图像分析软件Image-Pro Plus 6.O测定代表表达水平的平均光密度值（OD）。6、Western Blot用浓度分别为表柔比星5.4μmol/L、丝裂霉素9.3μmol/L,处理后的A549细胞,以凯基核蛋白和胞质蛋白提取试剂盒来提取所需的胞质蛋白和核蛋白;Lorry法蛋白定量;60V电泳至染料带进入分离胶后,100V电泳2-3小时左右;转印;NC膜在1×TBS中浸泡10分钟,封闭1小时;1×TTBS洗膜两次,每次5分钟,NC膜在一抗溶液中浸泡过夜（4℃）。NC膜从一抗溶液中取出,用1×TBS快速洗一次,用1×TTBS洗膜两次,每次5分钟,NC膜转到二抗溶液中浸泡2小时（室温）,1×TTBS洗膜两次,每次5分钟,1×TBS洗膜5分钟,NBT/BCIP染色至条带呈现,终止染色。NC膜在滤纸中干燥保存,用GIS-2020凝胶图象分析系统扫描分析结果。7、RT-PCR取用浓度分别为表柔比星5.4μmol/L、丝裂霉素9.3μmol/L处理后的A549细胞,RNAout提取总RNA;取1μg,加入oligo dT、反转录酶及dNTP等行反转录;反转录加入引物:Bcl-2（151bp）5’ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA3’5’CTCAGCCCAGACTCACATCA3’cyclinD3（230bp）5’TGTTTCCTGTCCCTGGTAGG3’5’CCCTCCCATTTAAGGTGGTT3’nm23（192bp）5’CATTGCGATCAAACCAGATG3’5’GGCCCTGAGTGCATGTATTT3’β-actin（513bp）5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3’5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’行PCR扩增,扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,用GIS-2020凝胶扫描成像分析系统扫描各扩增产物,以β-actin吸光度值标化目的产物吸光度值,得到目的产物相对含量。8、统计分析数据以（（?）±s）表示,采用多因素方差分析、单因素方差分析及LSD、Student-Newman-Keuls法（q检验）做多重比较。SPSS11.5处理数据。实验结果经不同浓度的表柔比星、丝裂霉素作用24小时后,A549细胞增殖明显出现抑制,增殖抑制程度依赖浓度。流式细胞仪定量检测经低浓度表柔比星、丝裂霉素处理24小时的A549细胞各时期的百分率,与空白对照组比较,G1/G0期细胞比例明显增加,G2/M期细胞比例明显减少,表明细胞增殖受到抑制,细胞停留在G1期,出现G1/S期阻滞。细胞的形态学观查:Giemsa染色显示A549贴壁细胞较对照组染色加深、分裂细胞减少、不对称核分裂减少、细胞多形性减少。倒置显微镜和吖啶橙荧光染色见无明显细胞破坏。罗丹明123荧光染色见处理组细胞线粒体粗大、分散。经电子显微镜观察,处理组A549细胞线粒体肿胀、变圆、线粒体嵴模糊不清至线粒体空泡化改变、细胞表面绒毛脱落、核质浓缩。免疫组织化学法检测Rb:药物作用24小时后,A549贴壁细胞Rb基因的表达增高,药物组的平均OD值均较对照组增高（P＜0.01）,说明两药对肺癌细胞中Rb的表达均具有上调作用。Western Blot显示:caspase3在处理组中较对照表达不同程度增强;p21在处理组中较对照表达不同程度增强;RARα在表柔比星组中较对照表达增强。均有统计学差异。RT-PCR显示:bcl-2、cyclinD3在所有处理组中均较对照表达减弱;nm23表达增强;对照组与各药物组之间有显著性差异。结论1、低浓度的表柔比星和丝裂霉素作用于肺癌细胞A549后,使A549细胞发生G1/S期阻滞,导致细胞增殖抑制。2、低浓度的表柔比星和丝裂霉素作用于肺癌细胞A549后,引起抑癌基因Rb表达水平的上调。Rb基因水平的上调参与了细胞周期的阻滞调控。3、低浓度表柔比星与丝裂霉素作用于肺癌细胞A549后,诱导肺癌细胞趋向正常细胞分化。4、低浓度表柔比星与丝裂霉素作用于肺癌细胞A549后,线粒体的改变明显,可能参与了细胞的分化调控。5、低浓度表柔比星与丝裂霉素作用于肺癌细胞A549后,癌基因表达水平下调,抑癌基因表达上调,多基因表达水平的改变参与了肿瘤细胞的分化调节。