百脉根小GTPase ROP6与网格重链蛋白CHC相互作用的研究

论文摘要

根瘤菌所产生的结瘤因子是豆科植物与根瘤菌建立共生固氮体系的信号分子,豆科植物LysM-RLK是识别根瘤菌结瘤因子的受体激酶。在模式豆科植物百脉根中结瘤因子受体激酶被命名为NFR1和NFR5,它们可能形成异源二聚体共同识别和接受结瘤因子而开启宿主内共生信号转导途径。为了深入理解豆科植物与根瘤菌共生体形成的机制,本研究在分离到与结瘤因子受体激酶NFR5相互作用的小G蛋白ROP6的基础上,通过酵母双杂交技术,从百脉根AD-cDNA文库中筛选并鉴定出与ROP6相互作用的阳性克隆。主要研究结果如下：1.对得到的酵母阳性克隆子,经分离靶质粒、PCR扩增、酶切鉴定证实含有外源片段及其大小,并通过回转酵母进一步验证与诱饵质粒上ROP6间的相互作用。然后,经DNA序列测定和NCBI数据库BLAST分析结果表明,其目的DNA编码网格重链蛋白CHC的两个模体,命名为CHCR。2.在酵母体内研究了网格重链蛋白CHCR与ROP6、CA突变体（ROP6组成型活化突变体）和DN突变体（ROP6功能缺失突变体）间的相互作用。实验结果表明,ROP6的两种突变体都能与网格重链蛋白CHCR互相作用。3.分别在大肠杆菌中表达并纯化CBD-CHCR和His-ROP6融合蛋白,利用Pull-down技术证实了CHCR和ROP6的体外相互作用。同时,双分子荧光互补（BiFC）研究结果说明了CHCR和ROP6在烟草叶片表皮细胞中的相互作用。4.利用酵母双杂交技术,研究了与ROP6相互作用的CHCR模体,含单个CHCR模体的蛋白不能与ROP6相互作用；同时含有2个CHCR模体的蛋白才能与ROP6相互作用。5.以CHCR为诱饵蛋白筛选百脉根cDNA文库,获得了网格轻链蛋白和C3HC4类型的E3连接酶的RING结构域。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略表
• 1 前言
• 1.1 共生固氮的概念及意义
• 1.2 豆科植物与根瘤菌根瘤共生固氮体系
• 1.2.1 根瘤菌和豆科植物
• 1.2.2 根瘤的形成
• 1.3 根瘤菌中参与的结瘤基因
• 1.4 结瘤因子
• 1.5 豆科植物信号转导途径
• 1.6 百脉根结瘤因子受体蛋白激酶
• 1.7 小G蛋白
• 1.8 网格重链蛋白
• 1.9 网格蛋白介导的胞吞作用机制
• 1.10 酵母双杂交系统
• 1.11 双分子荧光互补技术（BiFC）
• 1.12 本实验的研究目的、内容和实验技术路线
• 2. 实验材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 PCR引物和测序
• 2.1.5 缓冲液和反应试剂
• 2.1.5.1 酵母双杂交系统试剂
• 2.1.5.2 β-半乳糖苷酶检测试剂
• 2.1.5.3 蛋白质纯化试剂
• 2.1.5.4 DNA琼脂糖电泳试剂
• 2.1.5.5 蛋白质电泳试剂
• 2.1.5.6 Western Blot试剂
• 2.1.5.7 抽提烟草表达蛋白试剂
• 2.1.5.8 其他相关化学试剂
• 2.1.6 主要分子生物学试剂及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 基本分子生物学方法
• 2.2.1.1 DNA体外重组法
• 2.2.1.2 DNA其它操作方法
• 2.2.2 植物材料的预处理
• 2.2.3 总RNA的提取
• 2.2.4 RT-PCR反应
• 2.2.4.1 反转录反应
• 2.2.4.2 PCR反应
• 2.2.5 CHCR基因的分离鉴定和诱饵质粒的构建及检测
• 2.2.5.1 CHCR基因的鉴定分离
• 2.2.5.2 CHCR诱饵载体的构建
• 2.2.5.3 CHCR缺失突变体在pGADT7上的融合
• 2.2.5.4 诱饵蛋白转录激活活性和毒性的检测
• 2.2.5.5 酵母质粒的转化
• 2.2.6 酵母AD-cDNA文库的筛选和阳性克隆的鉴定
• 2.2.6.1 酵母文库的初步筛选
• 2.2.6.2 复筛
• 2.2.6.3 酵母质粒的抽提
• 2.2.6.4 文库质粒的分离和鉴定
• 2.2.7 小范围mating
• 2.2.8 β-半乳糖苷酶活性检测
• 2.2.9 蛋白质纯化
• 2.2.9.1 靶蛋白的诱导表达
• 2.2.9.2 融合蛋白的纯化
• 2.2.9.3 融合蛋白包涵体纯化
• 2.2.9.4 抗体制备
• 2.2.10 Western Blotting
• 2.2.11 双分子荧光互补技术（BiFC）的应用和分析
• 2.2.11.1 BiFC载体的构建
• 2.2.11.2 蛋白烟草叶片的表达
• 2.2.11.3 蛋白烟草叶片表达的目标蛋白的抽提
• 3. 结果与分析
• 3.1 百脉根网格重链蛋白CHCR的分离和鉴定
• 3.2 网格重链蛋白的生物信息学分析
• 3.2.1 网格蛋白基因组分析
• 3.2.2 网格重链蛋白的生物进化分析
• 3.2.3 CHCR蛋白的结构分析
• 3.3 CHCR与ROP6蛋白的相互作用
• 3.3.1 CHCR与ROP6蛋白的体内相互作用
• 3.3.2 CHCR与ROP6蛋白的体外相互作用
• 3.3.3 CHCR与ROP6的双分子荧光互补技术（BiFC）的验证
• 3.4 CHCR与ROP6相互作用结构域探索
• 3.5 CHCR筛选百脉根cDNA文库
• 4 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.2 讨论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 致谢