论文摘要
JAK/STAT信号转导通路发现于干扰素的信号转导研究中,是细胞因子信息内传的一条重要通道,涉及免疫、炎症等多种生理、病理过程。MAPKs信号转导通路在体内多种生长因子的信号转导中发挥重要作用,不仅参与细胞增殖信号传递,也是调控细胞炎症和应激信号的重要蛋白。双环醇（商品名:百赛诺,Bicyclol;化学名:4,4′-二甲氧基-5,6,5′,6′-双（亚甲二氧基）-2-羟甲基-2′-甲氧羰基联苯）是中国医学科学院药物研究所研制的抗肝炎新药。前期药理研究表明,双环醇对多种化学性和免疫性肝损伤均有较强的保护作用,其肝保护作用机制与抑制氧化损伤及炎症因子调控密切相关。但双环醇上述作用与JAK/STAT及MAPKs细胞信号转导通路关系尚不完全明了。本研究拟观察免疫性（con A）肝损伤及HBV DNA转基因小鼠肝脏JAK/STAT细胞信号通路变化,以及双环醇对JAK/STAT细胞信号通路调控作用。同时本研究观察双环醇对顺铂引起肝肾损伤的保护作用及机制。第一部分双环醇对Con A肝损伤小鼠及HBV转基因小鼠肝脏细胞信号转导通路影响1.双环醇对Con A肝损伤小鼠肝脏TNF-α/NF-κB及IFN-γ/STAT1信号转导通路影响本研究应用Con A免疫性肝损伤动物模型,观察病理状态下TNF-α/NF-κB及IFN-γ/STAT1信号转导通路对相关细胞因子的调控及双环醇对TNF-α/NF-κB及IFN-γ/STAT1的影响,进一步探讨双环醇调控肝脏免疫炎症因子表达失衡的分子机制。小鼠尾静脉注射Con A（25mg/kg）可引起急性肝损伤,表现为血清转氨酶升高及肝组织出现严重坏死及炎症细胞浸润。双环醇口服给药（200mg/kg,qd×4）可显著降低Con A引起的小鼠血清ALT及AST异常增高,肝组织形态学改变也明显改善。Con A引起肝损伤的发病机制中,炎症因子的水平升高是产生损伤的主要因素。注射Con A后,小鼠血清炎症因子TNF-α及IFN-γ水平显著升高,分别于2h及8h达峰。双环醇预防给药可抑制Con A引起的血清TNF-α及IFN-γ水平升高,并下调IFN-γmRNA在肝组织的表达。IκB的降解及NF-κB表达上调是TNF-α信号转导通路的重要环节。活化的NF-κB可通过诱导iNOS表达,产生大量NO,导致肝细胞损伤。Con A注射后1h,小鼠肝脏IκB水平即有降低,NF-κB水平同时升高,导致小鼠肝脏iNOS水平升高,血清NO含量增加。双环醇可抑制Con A肝损伤小鼠肝脏IκB降解和NF-κB表达升高,下调肝脏iNOS水平,从而显著抑制血清NO异常升高。在IFN-γ介导的免疫性肝损伤发生发展过程中,IFN-γ主要通过诱导STAT-1同源二聚体的生成而参与信号转导。小鼠注射Con A后,肝脏pSTAT1水平升高,其信号转导的下游因子IRF-1和负反馈抑制因子SOCS1表达也同时上调。双环醇在保护肝损伤的同时可抑制小鼠肝脏pSTAT1及IRF-1的表达,同时,进一步上调肝脏SOCS1表达。已知黏附分子ICAM-1/LFA-1可介导肝脏炎性反应时的细胞黏附,导致肝细胞损伤。小鼠注射Con A后,肝组织ICAM-1及其受体LFA-1的表达明显增加,双环醇可明显抑制上述细胞因子在肝组织的异常表达。本研究还采用基因芯片技术研究双环醇口服给药对小鼠肝脏基因表达谱的影响。结果表明,双环醇给药后小鼠肝脏287条基因发生差异表达,占芯片基因总数的7%,其中表达下调基因166条,上调基因121条。差异表达的基因涉及代谢、离子通道及细胞色素P450相关基因45条;炎症与应激、凋亡相关基因32条;免疫相关基因11条;细胞周期调控、信号传导及再生相关基因27条;疾病特异表达基因与原癌基因14条;其他功能基因26条。上述结果将为后续研究提供参考。本研究结果表明,双环醇对Con A引起肝损伤的保护作用机制与下调炎症因子TNF-α、IFN-γ水平,抑制STAT1磷酸化及上调STAT1的负反馈抑制因子SOCS1的表达,阻断IFN-γ信号转导密切相关。双环醇还可通过抑制IκB降解及NF-κB活化而降低iNOS表达,继而减少Con A引起的NO水平升高。2.双环醇对HBV转基因小鼠体内HBV DNA复制及JAK/STAT信号转导通路的影响已知抗肝炎病毒药物除可直接抑制HBV DNA聚合酶,还可通过活化NKT细胞和CTL细胞功能,诱导干扰素合成,和/或活化干扰素信号转导通路,促进抗病毒蛋白的合成。上述两种途径都涉及到干扰素信号转导通路蛋白（JAK/STAT）的活化和转位。本研究应用HBV转基因小鼠及HepG2.2.1.5细胞研究双环醇对HBV DNA复制影响与JAK/STAT信号通路的关系。研究结果表明,双环醇可降低HBV转基因小鼠血清HBV DNA水平（5×103copies/ml vs 6×105copies/ml）。此外,双环醇对HepG 2.2.1.5 HBV DNA复制也有一定抑制作用（1.5×105copies/ml vs 4.5×105copies/ml）。本研究还发现,HBV转基因小鼠血清IFN-γ水平及肝脏pSTAT1/3,IRF-1表达未见显著变化,双环醇对上述指标亦无影响。上述结果提示,双环醇对HBV转基因小鼠HBV DNA复制有一定抑制作用,但此作用与调控JAK/STAT信号转导通路无明显相关性。第二部分双环醇对顺铂中毒小鼠肝脏及肾脏损伤的保护作用及机制研究顺铂是临床上常用的广谱抗癌药,但其导致的肝肾损伤影响其临床应用和疗效,目前尚无满意的治疗药物。本研究模拟临床常规的给药方式,建立了顺铂引起小鼠肝、肾损伤的实验动物模型,研究双环醇对顺铂肝肾损伤的保护作用及分子机制,并观察双环醇在保护顺铂肝肾毒性的同时对顺铂抗肿瘤作用的影响,为临床应用提供有价值的实验依据。双环醇对顺铂引起的肝肾损伤具有较好的保护作用,不仅可明显降低顺铂引起的血清CRE/BUN和转氨酶的升高,肾脏和肝脏病理损伤也明显减轻。小鼠腹腔注射顺铂后,肝脏与肾脏抗氧化物SOD,CAT及GSH-px活性均显著降低,GSH含量也显著下降,而脂质过氧化产物MDA显著升高。双环醇可抑制肝肾组织内MDA的升高和GSH的下降,SOD、CAT及GSH-px活性也明显改善。同时,双环醇可阻断顺铂中毒小鼠肝脏iNOS的表达升高,降低肝脏NO水平,抑制肝脏3-NT的过表达。此外,双环醇可阻断顺铂引起肝脏ERK1/2、Elk-1、p38 MAPK、p53的磷酸化及calpain异常激活。双环醇在保护顺铂引起肝肾损伤的同时,对顺铂的抑瘤率无明显影响（H22肿瘤抑制率:顺铂单用85.7%,与双环醇250mg/kg合用83.5%）。由此可见,双环醇对顺铂引起肝肾损伤的保护作用可归纳为抑制氧化损伤,恢复抗氧化物水平达到细胞保护作用。同时,双环醇可抑制顺铂引起的肝脏iNOS表达上调,降低NO水平从而抑制氧化与硝化应激,阻断蛋白质硝基化。双环醇抑制氧化与硝化应激与调控肝脏p38 MAPK及ERK1/2活化及其下游因子激活密切相关。综上所述,双环醇对上述免疫性和药物性肝损伤的保护作用与JAK/STAT及MAPKs细胞信号转导通路关系可归纳如下:1.双环醇可通过调控TNF-α/NF-κB信号转导通路,抑制IκB降解及NF-κB活化,从而降低Con A引起的小鼠肝脏iNOS表达上调及NO生成。2.双环醇可抑制Con A引起的STAT1及其下游前凋亡因子IRF-1的活化,上述作用是通过上调SOCS1实现。3.双环醇对HBV转基因小鼠及HepG2.2.1.5细胞HBV DNA复制的抑制作用与JAK/STAT细胞信号转导通路无关。4.双环醇对顺铂引起的小鼠肝肾损伤均有明显的保护作用,上述作用与双环醇抑制顺铂引起的肝肾氧化/硝化应激相关。5.双环醇对顺铂肝肾损伤的保护作用与调控ERK1/2及p38 MAPK及其下游因子有关。6.双环醇在保护顺铂中毒小鼠肝、肾损伤的同时不影响顺铂对H22实体瘤的抑制作用。本研究从保护免疫性和药物性肝损伤的角度进一步丰富了对双环醇作用分子机制的了解,发现双环醇可通过抑制炎症因子表达及抗氧化/硝化应激而保护肝细胞损伤,其保护机制与调控JAK/STAT及MAPKs信号转导通路密切相关。上述结果为临床适应症的选择和提高疗效提供了有参考价值的实验依据。