论文摘要
刺参（Apostichopus japonicus）是滋补和药用的精品,20世纪90年代末在我国的山东和辽宁两省掀起了刺参人工养殖的热潮,刺参已成为推动我国北方沿海养殖业发展的新兴养殖品种。随着养殖规模的不断增大,刺参病害也日益显著,自2003年起,各地的养殖刺参频发溃疡病,严重制约了刺参养殖业的迅速发展。因此进行刺参溃疡病流行病学及致病机理的研究成为迫在眉睫的课题。本研究从患溃疡病刺参病灶处分离到2株优势菌（H1和RH2）,人工感染实验证实2株菌均具有致病性,其中H1为强毒力菌株,RH2为弱毒力菌株,并在此基础上对2株病原菌进行了鉴定。提取强毒力菌株H1的胞外产物（extracellular products,ECP）,并对ECP的致病性、含有的酶种类、酶比活力、蛋白组成以及抗原性等特性进行了分析。利用凝胶排阻层析和阴离子交换层析从ECP中分离纯化出一种丝氨酸蛋白酶,致病性实验证明其为菌株H1的毒力因子,从生物酶学和蛋白质组学角度对该蛋白酶的特性进行了分析。具体方法和结果如下:2005年3月,山东省乳山刺参养殖场发生大规模刺参溃疡病,症状为厌食、体表溃疡、肿嘴、吐肠、最后自溶死亡。从患溃疡病刺参病灶处分离到2株优势菌（H1和RH2）,采用浸浴、创伤浸浴、体腔注射和体壁肌肉注射等4种方式对刺参进行感染,结果证明2株菌均具有致病性,其中H1为强毒力菌株,可通过体壁创伤浸浴和体壁肌肉注射方式感染刺参,且在水温较低时毒力较强,对刺参的半致死浓度（LD50）高达1.4×106CFU/尾;RH2为弱毒力菌株,仅能以体壁肌肉注射方式感染刺参,其对刺参的半致死浓度（LD50）为5.7×106CFU/尾。常规生理生化指标鉴定菌株H1为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种（Aeromonas salmonicida masoucida）,菌株RH2为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）;在此基础上测定了菌株RH2的16S rRNA基因序列和热激蛋白HSP60（Heat shock protein,HSP）基因序列,在NCBI上进行同源性检索并进行系统发育学分析,结果显示在以16S rRNA基因构建的系统发育树中菌株RH2与V.alginolyticu（sAF513447）自然聚合,置信度为50%,而在以HSP60基因构建的系统发育树中菌株RH2与V.alginolyticus（AY332570、AF230931）聚为一个分支,置信度高达99%。采用玻璃纸平板法提取强毒力菌株H1的胞外产物（ECP）,其能够引起刺参死亡,症状与自然发病者相似,对刺参的半致死量为5.24μg蛋白/g体重;ECP中具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、几丁质酶和淀粉酶活性,并具有溶血性;通过对底物azocasin作用的情况来检测ECP的蛋白酶活性,作用温度为25℃时其酶比活力为470.6活力单位/mg蛋白,其与底物的最适作用温度为50℃,且对热不稳定,当温度超过40℃时,酶活呈下降趋势,超过70℃时,酶即被灭活。用SDS-PAGE对ECP结构进行分析,发现组成ECP的蛋白有大约13条蛋白带,其中主要条带有9条;利用鼠抗ECP血清进行Western-blot分析,结果显示ECP的13条蛋白带中有7条具有免疫原性,能够激发机体产生免疫应答分泌抗体。利用Sephadex G-100凝胶排阻层析和DEAE阴离子交换层析对ECP中的毒力因子进行纯化,结果得到一种分子量为42 kDa的蛋白酶,其能够引起刺参死亡,症状与菌株H1引发刺参死亡的症状相似,对刺参的半致死量为1.12μg/g体重,是ECP毒力的4.7倍,表明该蛋白酶为菌株H1的毒力因子。从培养上清开始,经过几个步骤的纯化蛋白酶的产率为1.7%,而其酶比活力增加了21.9倍。该蛋白酶与底物的最适作用为40℃,最适作用pH为8.0,对热不稳定,70℃时即被灭活;蛋白酶可被5 mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制98%的酶活,Ca2+和Mg2+可分别提高9%和3%的酶比活力。测定蛋白酶N末端15个氨基酸残基序列,NCBI同源检索结果显示与丝氨酸蛋白酶同源性最高。蛋白酶的双向电泳显示分子量为42 kDa的蛋白酶是由等电点偏碱性的两种蛋白质组成。