比目鱼类变态过程中细胞分裂的作用和甲状腺激素受体时空表达图式

论文摘要

两侧对称对于生物的进化具有重要意义,左右轴的形成在两侧对称动物的发育过程中的作用至关重要。但是在进化过程中,脊椎动物的某些两侧对称特征也有被打破的现象。例如,人类虽然外表上是左右对称,但是内脏器官却是左右不对称分布的,如心脏长在左侧,肝脏长在右侧。鱼类的松果旁体本是位于脑部的中间线上,但是在发育的一定阶段,松果旁体偏向左侧迁移,开始不对称的形态发生过程。其中比目鱼类是脊椎动物中两侧对称特征被打破的最严重的一类。比目鱼最显著的特征是比目鱼仔鱼向稚鱼发育过程中,其中一只眼睛会绕过头顶移动到身体的另一侧,同时伴随着头骨向有眼侧扭曲变形,外部形态从两侧对称变成了左右不对称。关于比目鱼的进化起源曾有过争论,直到Friedman在2008年发现了眼睛仅部分移动的比目鱼进化中间阶段的化石证据,才让我们完全弄清比目鱼眼睛移动的进化过程是循序渐进的过程,但是对于比目鱼眼睛移动机制目前还不是很清楚。大多数研究均认为眼睛的移动是由头部骨骼扭曲变形所导致的,然而骨骼变形的发生不仅在时间上晚于眼睛移动,而且在空间上也距离眼睛较远,其作用力不是最有效的力。另外,比目鱼的变态发育过程受甲状腺激素调控已很清楚,但是对其核内受体的基因表达研究还仅局限在全身表达量的发育变化上。甲状腺激素受体的空间表达图式的研究对于建立甲状腺激素受体的基因表达与组织器官发育之间的联系至关重要。本研究认为比目鱼类眼睛移动的力来自移动侧眶下组织的细胞分裂,而不是头部骨骼变形。本研究通过建立并优化了大型仔鱼的整体细胞分裂技术和整体原位杂交技术,弄清在比目鱼类变态发育过程中细胞分裂的图式和甲状腺激素受体的基因表达图式。研究对象采用了鲽形目鲽亚目和鳎亚目的四个代表物种,分别是鲽亚目的牙鲆( Paralichthys olivaceus )(右眼移动)与黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)(左眼移动),鳎亚目的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)(右眼移动)与塞内加尔鳎(Solea senegalensis)(左眼移动)。研究发现了在比目鱼类眼睛移动过程中左右侧的细胞分裂的不对称分布图式。在眼睛移动前,移动侧眼睛眶下组织的细胞分裂明显强于另一侧,这一不对称的细胞分裂一直持续到变态高峰期并在移动眼睛下方形成一条细胞分裂带。利用显微注射技术,在眼睛移动之前,将细胞分裂抑制剂——秋水仙素注射到移动侧眼睛眶下组织中,可以抑制眼睛移动,并首次得到了两眼对称而其它变态事件正常进行的比目鱼。检测结果发现注射秋水仙素后细胞分裂的确被抑制,证实了眼睛移动的动力来自眶下组织的细胞分裂,纠正了现有关于比目鱼眼睛移动是由头骨变形造成的假说。另外,通过整体原位杂交技术首次研究了甲状腺激素受体在牙鲆眼睛移动过程中的表达图式。发现TRs四种亚型在眼睛移动过程中眼睛周围组织中均有表达,包括眶下组织、眶上组织、侧筛骨和额骨等,其中TRβ1是调控眼睛起始移动的一个重要候选基因。同时也发现TR与变态发育过程中体节的生长、骨骼的发育、鳍条的分化、消化系统的再造等变态事件相关。总之,本论文研究中的结果:比目鱼的眼睛移动是由移动侧眶下组织细胞分裂所推动,抑制眶下组织细胞分裂获得两眼对称比目鱼以及TRs基因在牙鲆眼睛移动过程中的整体空间表达图式,将比目鱼类眼睛移动机制的研究向前推进了重要的一步。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 眶下组织的细胞分裂驱动比目鱼眼睛移动
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 仔鱼饲养
• 1.1.3 整体细胞分裂检测仔鱼样本采集
• 1.1.4 整体BrdU 免疫组织化学检测
• 1.1.5 显微注射实验
• 1.1.6 显微注射仔鱼的细胞分裂检测
• 1.2 结果
• 1.2.1 眼睛移动过程中细胞分裂的左右不对称分布
• 1.2.2 抑制细胞分裂可以抑制眼睛移动
• 1.3 讨论
• 1.3.1 眶下组织的细胞分裂驱动比目鱼眼睛移动
• 1.3.2 细胞分裂推动眼睛移动的模型
• 第二章 比目鱼变态过程中细胞分裂的分布图式
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 仔鱼饲养
• 2.1.3 整体细胞分裂检测仔鱼样本采集
• 2.1.4 整体BrdU 免疫组织化学检测
• 2.1.5 体长体高数据采集
• 2.2 结果
• 2.2.1 塞内加尔鳎变态过程中整体细胞分裂分布图式
• 2.2.2 半滑舌鳎变态过程中整体细胞分裂分布图式
• 2.2.3 牙鲆变态过程中整体细胞分裂分布图式
• 2.2.4 黄盖鲽变态过程中整体细胞分裂分布图式
• 2.3 讨论
• 2.3.1 比目鱼变态发育过程中侧扁体型的形成
• 2.3.2 比目鱼变态发育过程中组织器官再造
• 第三章 甲状腺激素受体在变态发育过程中的空间分布
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 原位杂交样本采集
• 3.1.2 牙鲆总RNA 抽提
• 3.1.3 牙鲆TR 探针引物设计
• 3.1.4 牙鲆TR 探针序列克隆
• 3.1.5 碱裂解法中量制备质粒DNA
• 3.1.6 质粒酶切
• 3.1.7 转录反应
• 3.1.8 整体原位杂交
• 3.2 结果
• 3.2.1 TRαA 基因整体表达图式
• 3.2.2 TRαB 基因整体表达图式
• 3.2.3 TRβ1 基因整体表达图式
• 3.2.4 TRβ2 基因整体表达图式
• 3.3 讨论
• 3.3.1 牙鲆TRs 基因表达在眼睛移动过程中的作用
• 3.3.2 牙鲆TRs 基因在变态过程中的组织特异表达与发育变化
• 3.3.3 牙鲆TRs 基因不同亚型的差异表达
• 小结
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢