论文摘要
脑血管因某种原因破裂致血液外溢到脑表面并充满蛛网膜下腔谓之脑蛛网膜下腔出血（SAH）,临床上将其分为创伤性和自发性两类,后者又分为原发性与继发性两种。因脑实质内出血血液穿破脑组织流入蛛网膜下腔者称继发性SAH;由各种原因引起脑底部及脑表面血管破裂使血液流入蛛网膜下腔者称为原发性SAH。一般所谓的SAH、非创伤性或自发性SAH指原发性SAH,这种SAH的85%病因是颅内动脉瘤破裂,形成动脉瘤性SAH（ASAH）,10%是中脑周围非动脉瘤性SAH（perimesencephalic nonaneurysmal subarachnoid hemorrhage,PNSH）,5%是其他罕见原因的SAH。SAH后大部分病人发生脑血管痉挛（CVS）,常引起严重局部脑组织缺血或迟发性缺血性脑损害,甚至导致脑梗死,致死和致残,但SAH及CVS的发病机制还不明确。本研究旨在从分子生物学和临床的角度探讨其发病机制,为临床制定确实有效的治疗方案,改善SAH病人的预后提供依据。第一部分蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛与内皮一氧化氮合酶基因多态相关研究目的:探讨内皮一氧化氮合酶基因的已知多态与蛛网膜下腔出血后发生脑血管痉挛的相关性。方法:1.实验分组:SAH无CVS组、ASAH有CVS组、TSAH有CVS组,其中ASAH有CVS组和TSAH有CVS组为实验组（98+96=194例）、SAH无CVS组为对照组（195例）。以家系为基础的相关性研究,为实验组194例和对照组100例。2.全部病人均作如下检查:包括3D-DSA、CT和TCCD检查。TCCD检测:颅外血管成像用4～12MHZ脉冲探头,颅内血管成像用2～4MHZ脉冲探头,将超声探头放置于颈部下段,胸锁乳突肌前缘锁骨上方,或通过颞窗及枕窗分别探测颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）、大脑前动脉（ACA）、大脑中动脉（MCA）、大脑后动脉（PCA）、基底动脉（BA）、椎动脉（VA）。分别记录各脑动脉的收缩峰血流速度（PSV）,平均血流速度（MVF）,舒张末期血流速度（EDV）。三组病人均在出血后的第3天和第7天各检测上述指标1次。3.抽血检查病人DNA,采用两对引物:决定T-786C含223个碱基对片段的多态的引物:上游引物是5’-GCATGCACTCTGGCCTGAAGTG-3’,下游引物是5’-CAGGAAGCTGCCTTCCAGTGC-3’;决定外显子7内含267个碱基对G894T的置换的片段的引物:上游引物是5’CTGGAGATGAAGGCAGGAGAC-3’下游引物是5’-CTCCATCCCACCCAGTCAATC-3’。通过聚合酶链反应（PCR）扩增:聚合酶链反应（PCR）是在50μl的总容积内含80 ng染色体DNA、50pmol的每种引物、200μmol/L dNTP、1.25U的TAQ FLDNA聚合酶（PGC Scientific Co.,Frederick,MD,USA）和5μl的10×PCR buffer缓冲液含15 mmol/L MgCl2（PGC Scientific Co.）。开始的变性温度为94℃反应5分钟、随后循环40次在94℃的条件下反应1分钟、55℃反应1分钟和77℃1分钟。在72℃下延伸5分钟使扩增完成。扩增后进行印迹:8微升的PCR扩增产物加入50μL的变性溶液[500 mmol/L NaOH、2.0 mol/L NaCl、25 mmol/L乙二胺四醋酸（EDTA）、0.0001%溴酚蓝]并在真空条件下将其转移到一个点印器具上的尼龙膜。转移后将膜浸入2×NaCl/枸橼酸钠溶液80℃下20分钟吸干。并通过决定T-786C多态采用两个17个碱基对的等位基因特异的寡核苷酸探针:序列为5’-CTGGC（?）GGCTGACCCTG-3’和5’CTGGCTGGCTGACCCTG-3’决定G894T多态采用两个17个碱基对的等位基因特异的寡核苷酸探针,序列如下:5’-GATGA（?）CCCCCGAACT-3’和5’GATGATCCCCCGAACT-3’进行杂交,检测内皮一氧化氮合酶基因的多态即基因型和等位基因频率。4.进行病例对照研究,采用SPSS13.0统计软件进行统计分析:连续变量比较采用T检验。在对照组和两个病例组基因型和等位基因频率比较采用标准卡方检验。根据Rothman的方法或分层卡方检验计算其优势比和其可信区间。结果:1.3D-DSA、CT和TCCD检查结果:389例SAH病人中,98例动脉瘤性SAH病人发生脑血管痉挛,96例外伤性SAH病人发生脑血管痉挛,未发生脑血管痉挛的病人有195例。2.检查了内皮一氧化氮合酶基因的四种多态,在病例对照比较中有两种多态与蛛网膜下腔出血后发生脑血管痉挛有关:在启动子的-786位点上一个T变成C的替换和在内含子4内的a缺失或b的插入。对于前者,C等位基因纯合体比另外两种基因型诱发脑血管痉挛的风险更高（优势比2.68,95%CI,1.4 to 5.2）。对于后者的多态,携带a缺失的个体比不携带的个体患病风险更高（优势比2.3,95%CI,1.3 to 3.8）。两种多态作为单倍型一起以家系为基础的研究采用传递不平衡分析进行了分析。C或者a缺失单倍型从杂合体亲代传递到成为有蛛网膜下腔出血且脑血管痉挛比期望的频率更高有统计学意义（P=0.005）。结论:内皮一氧化氮合酶的DNA序列的差异与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的发生有相关性。第二部分吸烟对动脉瘤性蛛网膜下腔出血病人脑循环影响的研究目的:探讨内皮一氧化氮合酶基因对吸烟的动脉瘤性蛛网膜下腔出血病人的脑循环的影响。方法:根据吸烟量（每年吸烟的量）≥200支和0支分为吸烟组和不吸烟组,其中吸烟组198例,不吸烟组196例。1.全部病人夜间禁食后收集血浆来测量总胆固醇、HDL胆固醇和甘油三酯水平。2.进行TCCD检测:颅外血管成像用4～12MHZ脉冲探头,颅内血管成像用2～4MHZ脉冲探头,将超声探头放置于颈部下段,胸锁乳突肌前缘锁骨上方,或通过颞窗分别探测颈内动脉（ICA）、大脑中动脉（MCA）。分别记录各脑动脉的收缩峰血流速度（Vs）,平均血流速度（Vm）,舒张末期血流速度（Vd）。三组病人均在出血后的第3天和第7天各检测上述指标1次。以公式:Vm=Vs+（Vd×2）/3计算平均流速。3.从外周血中提取DNA,以C0:TTT CTC CAG CCC CTC AGA TG;2684C:GGC（?）GA GGC AGG GTC AG（?） CG2684T:CAT CAA GCT CTT CCC TG（?） CTT0:AGG CCC AGC AAG GAT GTA GT为引物,采用等位基因特异性聚合酶链反应扩增:在总容积20ul:包括50ng基因组DNA、0.25μmol/L 2684T和2684C启动子、0.063μmol/L T0和C0启动子、62.5μmol/L dNTPs、45 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、11 mmol/L硫酸铵、6.7μmol/Lβ-巯基乙醇、4.5μmol/L EDTA、1.5mmol/L MgCl2、和0.4 U Taq聚合酶。起始温度为96℃,在94℃下30秒、60℃下30秒、72℃下20秒循环35次完成扩增。将内皮一氧化氮合酶基因的T-786C多态进行基因分型。通过尿中F2-异前列烷排泄物来评估吸烟者的氧化应激。4.采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。结果:1.吸烟者与不吸烟者间体重指数有差别（吸烟组:BMI:23.51±3.17kg/m2,不吸烟组:BMI:24.36±3.37 kg/m2,P=0.011）,吸烟者的甘油三酯水平更高（吸烟组:TG:1.59±0.53 mmol/L,不吸烟组:TG:1.37±0.49 mmol/L,P＜0.001）,吸烟者尿F2-异前列烷水平是不吸烟者的近两倍（吸烟组:1.75±0.63 ng/mg,不吸烟组:1.14±0.32 ng/mg,P＜0.001）。2.两组的基因型频率相互间无明显差别（x2=0.894,df=2,P=0.640＞0.05）。分析基因型T-786C对平均动脉压、大脑中动脉平均血流速度和颈内动脉平均血流速度的影响表明:在吸烟者中与杂合体TC和纯合体TT比较,CC纯合体的大脑中动脉平均血流速度显著性升高（Vm:TT 95.8±56.3,TC 94.1±51.3,CC160.9±58.5 cm/s P＜0.001）且颈内动脉平均血流速度增高有统计学意义（Vm:TT 67.6±41.4,TC 64.9±42.2,CC120.7±67.7 cm/s P=0.018）。相反,不吸烟者中三种基因型间的大脑中动脉平均血流速度（Vm:TT 94.3±55.9,TC93.6±57.9,CC 95.3±50.0 cm/s P=0.994）和颈内动脉平均血流速度（TT 65.3±37.9,TC 64.7±33.7,CC 66.4±29.2 cm/s P=0.985）无明显差别。3.平均动脉压在三种基因型中无论是吸烟者（TT 96.1±12.4,TC 94.9±12.2,CC 97.9±14.2,P=0.716）还是不吸烟者（TT 97.2±12.8,TC 95.6±11.3,CC 96.7±12.2,P=0.754）均无差别。结论:内皮一氧化氮合酶基因可改变吸烟的动脉瘤性蛛网膜下腔出血病人的脑循环,使脑血流速度增高。第三部分结合珠蛋白遗传多态性与动脉瘤性蛛网膜下腔出血的相关性探讨目的:探讨动脉瘤性蛛网膜下腔出血病人血中结合珠蛋白（Hp）表型和Hp基因频率的分布及其与病情严重程度之间的关系。方法:分为实验组和对照组,其中实验组病人197例,其中98例ASAH发生脑血管痉挛及99例未发生脑血管痉挛,即又分为未痉挛组和痉挛组,年龄28～79岁,平均年龄（39.9±14.8）岁,已排除有明显高血压、糖尿病、心脏病的病人;对照组195例正常人,年龄27～79岁,平均年龄（38±15.3）岁,无高血压、糖尿病、心脑血管病。其中痉挛组根据脑血管痉挛的程度分三分级:1级:局部血管痉挛范围不到50%,或者平均流速MCA120—140 cm/s,MCA/ICA的比值为3-4,或者DSA显示有痉挛但残留管径大于50%;2级:局部血管痉挛范围超过50%,或者平均流速MCA140-200 cm/s,MCA/ICA的比值为4-6,或者DSA显示有痉挛但残留管径为50%-25%;3级:弥漫而广泛的血管痉挛,或者平均流速MCA＞200 cm/s,MCA/ICA的比值大于或等于6,或者DSA显示有痉挛且残留管径小于25%分。同时采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳技术检测197例SAH病人和195例正常对照者血中Hp表型的分布。结果:（1）不同病情病人之间的Hp表型及Hp基因频率分布无明显差别（P＞0.05）。（2）实验组与对照组相比,Hp2-2和Hp2-1明显增高（P＜0.05）,Hp2基因频率明显增高（P＜0.05）。（3）痉挛组与未痉挛组相比,Hp2-2和Hp2-1明显增高（P＜0.05）,Hp2基因频率明显增高（P＜0.05）。结论:血清有Hp2-1和Hp2-2的人群可能对脑血管痉挛有遗传易感性。Hp2基因在未痉挛组和痉挛组病人中有聚集现象,与其遗传易感性增高有某种内在联系,可能在CVS发病及发展中起一定作用。第四部分载脂蛋白E基因多态性与动脉瘤性蛛网膜下腔出血的相关性研究目的:探讨载脂蛋白E（APOE）基因多态与动脉瘤性蛛网膜下腔出血（ASAH）及脑血管痉挛（CVS）间的相关程度。方法:1.研究对象及分类评估:实验组SAH病人,共197例,98例发生脑血管痉挛（CVS）及99例未发生脑血管痉挛,年龄28～79岁,平均年龄（39.9±14.8）岁,已排除有明显高血压、糖尿病、心脏病的病人;正常对照组195例,年龄27～79岁,平均年龄（38±15.3）岁,无高血压、糖尿病、心脑血管病。所有病人在入院时进行头颅CT扫描并根据Fisher分级、Hunt and Hess分级及世界神经外科医师联盟（WFNS）临床分级评分进行分类;术后6个月参照格拉斯哥预后评分（GOS）判断预后。2.标本采集:所有入选病人禁食12 h后,抽清晨空腹血5 ml,其中2 ml血（EDTA抗凝）常规提取DNA进行APOE基因多态性分析;3ml血测定血脂、血糖等生化指标。3.血脂和载脂蛋白测定:血标本采集后,在同一台全自动生化分析仪进行总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL—C）、高密度脂蛋白（HDL—C）、载脂蛋白A（ApoA）与载脂蛋白B（ApoB）测定。4.基因组DNA提取:提取外周血基因组DNA作为PCR扩增模板,引物上游序列为:5’—TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA—3’,引物下游序列为:5’—ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA—3’。5.PCR扩增及Cfol内切酶消化:PCR扩增在20μl反应体系中进行,其中包括基因组DNA 200 ng,引物10pmol/L,4×dNTP各100μmol/L,氯化镁2.5 mol/L,二甲基亚砜10%（V/V）,TaqDNA聚合酶1U,并加入1滴矿物油覆盖反应物。然后进行95℃35 s变性,60℃35 s退火,70℃60 s延伸,共计30个循环,最后72℃延伸10min。限制性酶切反应也在20μl体系中进行,其中包括PCR反应产物12μl,Cfol内切酶8U（10 U/μl）,轻轻混匀后置于37℃消化过夜,消化产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳。6.银染:电泳后凝胶用蒸馏水冲洗2～3次,置于含10%乙醇和0.5%冰乙酸的固定液中固定10 min,然后用蒸馏水冲洗1～2次,用0.2%硝酸银染色8 min。再用蒸馏水冲洗凝胶数次,以显色液还原银颗粒,直至条带清晰。根据电泳图谱进行APOE基因分型。7.统计学处理:检测结果用SPSS13.0软件处理,率的比较采用卡方检验,组间均数的比较采用t检验。结果:1.APOE基因中含E4等位基因和不含E4等位基因的病人最初的临床情况和影像学检查结果很相似。2.APOE基因中含E4等位基因的68例病人中23例（34%）病人预后不良,而APOE基因中不含E4等位基因的129例病人中只有27（21%）例,两组相比有显著性差异（Z=-1.972,P=0.049）,含E4等位基因病人更易发生预后不良。3.脑血管痉挛组APOE4/3基因型和E4等位基因频率显著高于正常对照（P＜0.01和P＜0.05）。4.实验组的TC、LDL-C、APOB水平明显高于对照组,而HDL-C、APOA1水平则明显低于对照组。5.在不同APOE基因型亚组之间,TC、LDL-C、APOB水平均按E4亚组＞E3亚组＞E2亚组顺序递减;HDL-C、APOA1水平均按E4亚组＜E3亚组＜E2亚组顺序递增。E4等位基因携带者具有较高的TC、LDL-C、APOB水平;而E2等位基因携带者HDL-C、APOA1水平明显高于E4和E3等位基因携带者。结论:APOE等位基因多态与SAH后脑血管痉挛间存在相关。
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