论文摘要
目的:肿瘤细胞有着不同于正常细胞的代谢行为及细胞内代谢微环境。细胞在转化过程中伴随着许多应激反应,如代谢应激、氧化应激及蛋白质合成应激等,如果这些应激没有得到合理的控制,细胞的生长和转化将受阻。肿瘤细胞具有许多不同于正常细胞的代谢机制,这些异常的能量代谢方式对于维持和肿瘤相关的特定代谢微环境具有重要作用。本研究在前期工作的基础上,以肿瘤细胞中异常的脂肪酸代谢及肿瘤抑制因子Rb为切入点,采用细胞生物学和分子生物学技术,在细胞和软琼脂水平探索能量代谢平衡状态对细胞生长、转化的影响,阐明脂肪酸异常代谢以及肿瘤抑制因子Rb在控制与肿瘤相关的能量代谢平衡上所扮演的重要角色。方法:1、Western Blot方法检测乳腺癌细胞内源性FAS（脂肪酸合成的关键代谢酶）和CPT-1（脂肪酸氧化的关键代谢酶）蛋白表达量。2、计数法绘制细胞增殖曲线,MTT法检测细胞生存率。3、DCFH-DA探针和DHE探针测定细胞内ROS水平。试剂盒分析细胞内NADPH/NADP+比例。细胞内表达对氧化还原状态高度敏感蛋白Grx1-roGFP2的质粒,通过GFP400/GFP480的比值反映内-SH/-S-S比例的改变。4、应用慢病毒载体系统,用降表达质粒、恢复表达质粒、过表达质粒和空载体分别转染293T细胞,制备慢病毒,感染细胞,建立稳定细胞系。用Western Blot方法验证表达效果。5、应用软琼脂克隆形成实验方法检测细胞克隆形成能力。6、逆转录PCR方法检测细胞内线粒体膜蛋白mRNA的表达量。结果:1、乳腺癌细胞内脂肪酸合成及氧化途径中的关键代谢酶（FAS及CPT-1）的表达量与增殖速度之间无明显相关性。但是,它们仅在肿瘤细胞中才同时高表达。2、抑制脂肪酸的合成或氧化均能抑制肿瘤细胞的生长。脂肪酸代谢酶特异性抑制剂 cerulenin、orlistat、TOFA、Etomoxir 以及 TriacsinC 对乳腺癌 MCF-7、MDA-MB-231、BT474及SKBr3细胞均具有不同程度的杀伤作用。Cerulenin处理BT474细胞后,细胞内ROS水平升高,同时NADPH/NADP+比例迅速.升高。抗氧化剂能保护FAS抑制剂诱导的乳腺癌细胞凋亡,说明抑制脂肪酸代谢导致乳腺癌细胞凋亡主要通过ROS介导。3、Rb缺陷诱导细胞氧化应激和氧化还原代谢失衡。3T3Rb-/-细胞内ROS水平和-S-S-/SH 比例明显高于对照细胞。4、Rb缺陷诱导线粒体膜势能降低,并调控线粒体膜蛋白的表达。Bcl-XL过表达能够降低Rb缺陷诱导的氧化应激。结果提示,Rb失活导致的ROS及氧化还原失衡可能起源于线粒体。5、抗氧化剂NAC能够抑制Rb敲除3T3细胞内ROS,促进线粒体膜势能恢复Rb恢复表达能够降低Rb缺陷诱导的氧化应激,促进线粒体膜势能的恢复。6、氧化还原代谢平衡调节的细胞死亡取决于Rb的状态。抗氧化剂能诱导3T3wt凋亡,而Rb缺陷导致细胞对氧化剂敏感。7、Rb缺陷阻止H-RasV12对3T3细胞的转化。控制氧化还原平衡能够控制Rb缺陷的细胞转化。8、在3T3wt和3T3Rb-/-细胞中过表达Gpx1和GSR,结果发现3T3/Gpx1和3T3Rb-/-/GSR长出克隆,而软琼脂中的3T3/GSR和3T3Rb-/-/Gpx1细胞几乎全部崩解死亡,未见克隆形成,表明氧化还原代谢失衡是Rb控制能量代谢的重要机制。9、Rb降表达诱导乳腺上皮细胞MCF-10A氧化应激。用DCFDA和DHE探针检测了 MCF-10A/shRb细胞和对照细胞（MCF-10A/scramble）ROS水平的差异。结果发现,MCF-10A/shRb细胞ROS水平高于对照细胞。软琼脂克隆形成实验结果表明,在RasV12诱导下,MCF-10A/shRb细胞克隆形成数明显少于对照细胞,NAC能够促进RasV12诱导的MCA-10A/shRb细胞克隆形成。10、GSR沉默明显影响乳腺癌MCF-7细胞生长及克隆形成能力,表明谷胱甘肽、系统关键代谢酶对肿瘤细胞生长及转化起着极为重要的作用。11、Rb失活并不影响Ras对Du145的转化作用,NAC能够促进Du145/Ras细胞克隆形成。Rb及Ras活化的MCF-7细胞中沉默Rb,发现细胞生长速度没有明显改变,但是克隆形成能力明显降低。结论:1、肿瘤细胞中异常的“脂肪酸合成及氧化循环代谢平衡”通过维持细胞内的氧化还原代谢平衡来促进细胞的转化及生长。通过比较了四种乳腺癌细胞FAS和CPT-1表达量与细胞增殖速度的关系,推测脂肪酸代谢除了为快速增殖的肿瘤细胞提供营养和能量外,还应具备其他的生物学功能。进一步的实验证实,抑制乳腺癌细胞中的脂肪酸合成或氧化均能抑制肿瘤细胞的生长,且这种抑制能力是和导致氧化还原代谢失衡密切相关的,说明脂肪酸代谢平衡对于维持细胞内氧化还原状态具有极其重要的意义。2、从能量代谢角度出发,证实了 Rb能够控制细胞代谢平衡,并且通过控制代谢平衡调节细胞转化。调整GSH系统可以控制Rb对细胞代谢平衡的调节作用,提出Rb失活除了能够诱导细胞周期失控促进细胞转化外,还能通过导致代谢失衡抑制转化。3、本文从上述两个不同的角度,阐明了能量代谢平衡对于细胞生长转化的重要作用,有望为寻找有效的肿瘤治疗干预措施提供理论依据和新的思路。
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