紫杉醇微生物合成途径相关酶基因的克隆与表达

论文摘要

紫杉醇是一种从红豆杉树中发现的具有抗肿瘤作用的二萜类化合物,目前已广泛的在临床上应用于卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌等多种癌症的治疗,且疗效明显。紫杉醇的生产方法主要有红豆杉栽培法、化学合成法、细胞培养法、微生物发酵法等。药源不足是长期以来制约紫杉醇在临床中广泛应用的瓶颈问题,也成为研究的热点。利用基因工程技术构建紫杉醇高产菌株有望在较短的时间内显著提高紫杉醇产量,然而目前有关产紫杉醇微生物的遗传背景尚不清楚,对于微生物合成紫杉醇的代谢途径及相关酶的研究也未见报导,因此对于微生物合成紫杉醇的代谢途径及相关酶的研究及阐明十分必要。本试验研究以从东北红豆杉中分离的产紫杉醇内生真菌选育获得的工程菌株HDF-68为出发菌株,根据GenBank中紫杉醇生物合成途径相关酶基因序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆菌株HDF-68生物合成紫杉醇的相关酶基因。结果表明,本试验成功克隆得到了 GGPP合成酶、紫杉二烯5α-羟化酶、紫杉二烯5α-醇-乙酰基转运酶以及紫杉烷10β-羟化酶4种相关酶基因的cDNA全长;同时,通过Blast分析表明,得到的4种酶基因基因序列与GenBank中已经提交的相对应基因同源性达到99%-100%。将获得的酶基因片段双酶切后连接到具有相同双酶切位点的表达载体pET28a上,转化E.coli BL21（DE3）进行原核表达验证;用0.05mmol/LIPPTG诱导重组子进行表达培养,试验中研究了各自最佳诱导时间。SDS-PAGE电泳结果分析表明,克隆得到的酶基因片段中,GGPP合成酶基因、紫杉二烯5α-羟化酶基因以及紫杉二烯5α-醇-乙酰基转运酶基因均在E.coli BL21（ED3）中实现了高效表达。试验中同时对重组菌株蛋白表达形式进行了分析,结果表明,GGPP合成酶基因、紫杉二烯5α-羟化酶基因表达出了可溶性蛋白;另外,本试验对表达蛋白的基本性质及结构进行了生物信息学预测,为后续的进一步研究奠定了理论基础。本试验还将克隆得到的3条基因全长连接到pBI121-43双元表达载体上,利用根癌农杆菌介导法将3种基因转化入原始出发菌株HDF-68中,在特殊平板培养基上进行初步筛选阳性转化子,提取基因组DNA进行PCR验证。将阳性转化子转入S-7发酵培养基中培养12d,对发酵液中紫杉醇进行回收纯化,利用TLC及HPLC法对紫杉醇进行定性及定量分析。本试验研究为进一步分离微生物紫杉醇生物合成途径相关基因以及构建产量大幅提高的紫杉醇基因工程菌株奠定了基础,同时,也为阐明微生物紫杉醇生物合成途径提供了理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 紫杉醇的概述
• 1.1.1 紫杉醇的理化性质简介
• 1.1.2 紫杉醇抗癌作用及其生化机理研究进展
• 1.1.3 紫杉醇获取的途径
• 1.2 产紫杉醇红豆杉及其内生真菌的研究进展
• 1.2.1 产紫杉醇红豆杉简介
• 1.2.2 产紫杉醇内生真菌研究进展
• 1.3 对紫杉醇产生菌遗传改造研究
• 1.3.1 诱变育种法
• 1.3.2 原生质体融合法
• 1.3.3 基因组重排法
• 1.3.4 基因工程法
• 1.4 紫杉醇生物合成途径及相关酶基因研究进展
• 1.4.1 紫杉醇生物合成途径
• 1.4.2 紫杉醇生物合成途径中相关酶及其基因研究进展
• 1.5 基因克隆与表达
• 1.5.1 常用基因克隆方法简介
• 1.5.2 基因的外源表达
• 1.6 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化体系简介
• 1.6.1 根癌农杆菌介导的遗传转化真菌概述
• 1.6.2 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化的应用
• 1.7 本研究的目的意义及主要内容
• 1.7.1 本研究的目的意义
• 1.7.2 本研究的主要内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要生化与分子生物学试剂
• 2.1.5 主要仪器与设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 紫杉醇微生物合成途径中相关酶基因的克隆
• 2.2.2 克隆基因的测序及生物信息学分析
• 2.2.3 重组原核表达载体的构建与转化
• 2.2.4 目的基因在E.coli BL21中的诱导表达
• 2.2.5 目的基因与双元表达载体pBI121-43的连接
• 2.2.6 ATMT法构建紫杉醇高产基因工程菌株
• 2.2.7 HDF-68工程菌株发酵培养及紫杉醇产量检测
• 第3章 结果与分析
• 3.1 菌株总RNA的提取
• 3.2 RT-PCR法扩增目的片段的检测及分析
• 3.3 目的片段的测序及生物信息学分析
• 3.3.1 阳性克隆子的蓝白筛选
• 3.3.2 阳性克隆子的菌液PCR验证
• 3.3.3 阳性克隆子基因的测序与分析
• 3.4 目的片段与表达载体pET28a的连接及转化
• 3.4.1 测序质粒及pET28a表达载体的双酶切
• 3.4.2 阳性转化菌株的平板筛选
• 3.4.3 阳性转化菌株的酶切鉴定
• 3.5 目的基因的表达分析
• 3.5.1 重组菌株生长曲线的测定
• 3.5.2 目的基因的诱导表达及及产物检测分析
• 3.5.3 表达蛋白的性质及结构的生物信息学预测
• 3.6 紫杉醇高产基因工程菌株的构建
• 3.6.1 连接目的基因重组双元表达载体的双酶切
• 3.6.2 HDF-68阳性转化子PCR鉴定
• 3.7 HDF-68工程菌株发酵产紫杉醇定性定量分析
• 3.7.1 TLC试验结果与分析
• 3.7.2 HPLC试验结果与分析
• 第4章 讨论
• 4.1 高质量RNA的提取
• 4.2 引物设计的基本原则
• 4.3 利用RT-PCR方法克隆基因最佳条件的摸索
• 4.4 基因表达载体和系统的选择
• 4.5 外源基因在大肠杆菌中可溶性表达策略
• 4.6 包涵体蛋白的复性和纯化
• 4.7 利用根癌农杆菌介导法构建HDF-68基因工程菌株
• 4.7.1 适于HDF-68遗传转化的体系
• 4.7.2 HDF-68基因工程菌株构建的分析与意义
• 4.8 今后的工作
• 第5章 结论
• 第6章 本论文的主要创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 攻读硕士学位期间参与的研究课题