论文摘要
背景:肾脏的缺血再灌注损伤（IRI）导致急性肾功能衰竭（ARF）的发生率很高,治疗措施也有限,死亡率大约为30%～50%,因此防治肾脏IRI具有重要的意义,各国研究者都在寻求解决办法。针对IRI的研究很多,其中关于骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）对IRI肾脏的保护作用的研究是近年研究的热点。BM-MSCs移植可促进肾脏IRI的修复并改善肾功能,但是,移植的BM-MSCs数量有限,而且能到达损伤肾脏并发挥作用的BM-MSCs更少,因此, BM-MSCs的治疗作用受限。为了提高BM-MSCs的治疗作用,很多科学家采用基因治疗和细胞移植相结合的方法来进行研究,取得了一定的效果。骨形态发生蛋白-7（BMP-7）具有调控细胞增殖作用,对肾脏的发育和功能维持起着重要作用。研究表明,缺血再灌注后,肾脏BMP-7蛋白的表达明显减少,可能参与肾脏IRI的发病过程;应用外源性BMP-7基因治疗和蛋白治疗能促进肾功能的恢复,但缺乏靶向性,治疗效果有限。因此,本课题首次通过腺病毒载体将人BMP-7（hBMP-7）基因导入BM-MSCs,然后将基因修饰的BM-MSCs移植入动物体内,观测其对肾脏IRI的保护效用,并探讨其作用机制。据所查文献,目前尚未见国内外研究报道。目的:基于单纯BM-MSCs移植治疗或BMP-7基因治疗的不足,本课题拟采用BMP-7基因治疗和BM-MSCs移植治疗结合的方法,通过腺病毒介导hBMP-7基因转染BM-MSCs,观察基因修饰的BM-MSCs移植能否发挥更好的保护肾脏IRI的作用。方法:第一部分:Ad-hBMP-7的构建与鉴定酶切含hBMP-7基因的pBluescript sk（+）-hBMP-7质粒,构建穿梭质粒pDC316-hBMP-7,扩增、提纯后与骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre、脂质体共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组体Ad-hBMP-7,扩增、纯化后获得Ad-hBMP-7病毒液;对构建的质粒和腺病毒进行酶切、测序、ELISA和免疫组化鉴定。第二部分:Ad-hBMP-7体外转染兔BM-MSCs以及表达产物hBMP-7的测定采用密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法分离培养兔BM-MSCs,将Ad-hBMP-7转染体外培养的BM-MSCs,通过形态学和MTT法观察转染后BM-MSCs的生长情况,RT-PCR、免疫组化、Western Blot和ELISA检测目的基因hBMP-7在体外转染的BM-MSCs中的表达。第三部分:hBMP-7基因修饰的BM-MSCs移植对兔肾脏IRI的保护作用1.经兔胫骨抽取骨髓,分离培养BM-MSCs,移植前以MOI为100的腺病毒转染,并以Hoechst33342标记;2.建立兔肾脏冷缺血再灌注损伤模型:阻断血流后利用切除肾的残端对对侧肾进行冷盐水灌注后低温保存;3.所有实验兔随机分为6组:Ⅰ组为假手术组;Ⅱ组为IRI对照组;Ⅲ组:缺血再灌注后进行Ad-EGFP腺病毒转染的BM-MSCs移植;Ⅳ组:缺血再灌注后体内注射Ad-hBMP-7治疗;Ⅴ组:缺血再灌注后Ad-EGFP腺病毒转染的BM-MSCs移植联合Ad-hBMP-7体内注射治疗;Ⅵ组:缺血再灌注后进行Ad-hBMP-7腺病毒转染的BM-MSCs移植。4.各组分别在缺血再灌注后第3天、第7天和第14天进行相应指标的检测。RT-PCR、ELISA和Western Blot法检测目的基因hBMP-7在兔肾脏的表达;RT-PCR和ELISA法检测兔肾脏内源性BMP-7和TGF-β1的表达;比色法测定肾脏SOD活性和MDA含量;荧光显微镜下观察肾脏Hoechst33342阳性细胞以及Hoechst33342和CK18双阳性细胞数量以了解移植的BM-MSCs在肾脏的分布及其向肾小管上皮细胞的转化情况;免疫组化染色检测肾脏Bax和Bcl-2的含量并计算两者比值;进行PCNA免疫组化染色了解肾脏细胞增殖状态;TUNEL检测肾脏细胞凋亡情况;光镜和透射电镜下观察肾脏组织的组织学结构变化;测定肾脏功能（肌酐、尿素）。结果:1.酶切与测序证明成功构建了穿梭质粒pDC316- hBMP-7,将其与骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre、脂质体共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组体Ad-hBMP-7,扩增、纯化后获得Ad-hBMP-7病毒液,经PCR、ELISA和免疫组化鉴定,结果表明Ad-hBMP-7的构建正确;经TCID50法测定制备的Ad-hBMP-7病毒液滴度为7.94×1010IU/ml,可进行体内外转染实验。2.采用密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法成功分离培养BM-MSCs,确定Ad-hBMP-7体外转染BM-MSCs的最佳MOI值为100,转染效率达90.52%。Ad-hBMP-7转染的BM-MSCs与未转染的BM-MSCs相比,细胞形态未见明显改变,生长未见明显促进或抑制,说明构建的腺病毒转染是安全的。Ad-hBMP-7转染BM-MSCs后,ELISA法检测显示其上清液中有hBMP-7蛋白的分泌,细胞免疫组化和Western Blot检测显示细胞内有hBMP-7蛋白的表达,RT-PCR检测显示细胞内有hBMP-7 mRNA的表达;未转染组均为阴性。RT-PCR法、Western Blot法和ELISA法检测到hBMP-7的表达,在第3天达到高峰,并在此较高水平维持到第7天左右,然后开始缓慢下降,持续时间超过2周,满足体内实验的要求。3.①Hoechst33342标记BM-MSCs的方法可靠;成功建立肾脏冷缺血再灌注损伤模型,手术兔存活良好。②Ⅵ组通过RT-PCR、ELISA和western检测到hBMP-7 mRNA和蛋白在肾脏的表达,并明显高于Ⅳ组和Ⅴ组（P<0.05）。③荧光显微镜下心脏、肝脏、脾脏和肺脏均未见Hoechst33342阳性细胞;肾脏组织可见Hoechst33342阳性细胞,主要分布在肾脏的肾皮-髓质交界区的肾脏皮质内区和肾脏髓质外区的肾小管组织;VI组肾脏组织内Hoechst33342阳性细胞数在移植后各时间点均高于III组和V组（P<0.05）。Hoechst33342和CK18双阳性细胞代表移植的外源性BM-MSCs分化的肾小管上皮细胞,VI组肾脏组织内Hoechst33342和CK18双阳性细胞数在移植后各时间点均高于V组,差异有显著性（P<0.05）。④与Ⅰ组比较,Ⅱ组肾脏BMP-7 mRNA和蛋白明显降低,TGF-β1 mRNA和蛋白明显升高（P<0.05）; VI组肾脏BMP-7 mRNA和蛋白高于其它缺血再灌注组,TGF-β1 mRNA和蛋白低于其它缺血再灌注组（P<0.05）。与其它缺血再灌注组比较,VI组肾小管上皮细胞增殖指数（PI）、Bcl-2含量、Bcl-2/Bax比值最高,肾小管上皮细胞凋亡指数（AI）、Bax含量最低（P<0.05）。⑤缺血再灌注各组比较,VI组SOD活性最高,MDA含量最低（P<0.05）。⑥缺血再灌注各组比较,VI组肾脏组织学改变最轻,肌酐和尿素最低（P<0.05）。结论:1.成功构建含hBMP-7基因的重组腺病毒Ad-hBMP-7,能体外高效转染BM-MSCs而且不影响其生长增殖,可获得目的蛋白hBMP-7的有效表达;2.成功建立肾脏冷缺血再灌注损伤模型,更符合临床移植肾的损伤实际情况,并简化了操作,减轻了对血管的损伤。3. Ad-hBMP-7基因修饰的BM-MSCs能优先向损伤肾脏迁移,明显提高肾脏局部hBMP-7的表达,从而弥补肾脏内源性BMP-7表达降低的不足,发挥靶向性基因治疗作用;4.与单纯BM-MSCs移植或Ad-hBMP-7基因治疗或BM-MSCs移植和Ad- hBMP-7基因联合治疗相比,Ad-hBMP-7基因修饰的BM-MSCs移植能更明显地减轻肾脏损伤的程度,促进损伤肾脏的修复,改善肾脏功能。Ad-hBMP-7基因修饰的BM-MSCs移植能更好地保护肾脏IRI与BM-MSCs和肾脏局部高表达的hBMP-7协同发挥以下作用有关:明显降低脂质过氧化反应程度,增强机体清除自由基的能力;明显促进内源性BMP-7蛋白表达的恢复,降低TGF-β1的表达;明显上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白的表达,增加Bcl-2/Bax比值,从而促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进肾脏内源性修复;明显提高肾脏BM-MSCs的数量,并促进其转化,直接参与肾脏修复。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 骨形成蛋白论文; 细胞移植论文; 基因治疗论文; 肾脏论文; 缺血再灌注损伤论文; 修复论文; 保护作用论文;