论文摘要
结核病（tuberculosis, TB）是由人型结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）感染引起的以肺部慢性肉芽肿炎症病变为主的慢性传染病。虽然卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin, BCG）的全球接种曾一度较好地控制了结核病,然而,由于多重/广泛耐药结核菌株的出现、结核一线药物的失效、卡介苗在控制成人肺结核方面的逐步失效和艾滋病的合并感染,结核病已在全球死灰复燃。MTB目前已感染全球三分之一人口,2008年新增结核病例高达940万,死亡病例170万。在我国,目前近半数人口感染MTB,年新增病例150万,死亡病例13万。结核病已一跃成为我国传染性疾病的首位,成为制约我国社会经济发展的重要因素。作为目前唯一获准用于预防结核病的BCG,却仅能预防儿童结核病和肺外结核,无法预防成人肺结核。如无有效的预防控制措施,在未来10年内我国可能出现3000万新增结核病患者,形势严峻。因此,制备新型的可有效预防结核杆菌感染的疫苗及策略是控制结核病的当务之急。目前,广泛认为以分泌IFN-7的CD4+Thl细胞为特征的Th1型免疫应答在抗结核感染中发挥重要保护作用。为诱导多特异性Th1型细胞免疫,我所前期研究结核优势抗原Ag85A、Ag85B、ESAT-6和CFP10抗原,预测获得四个T细胞表位多肽,将其插入结核杆菌热休克蛋白HSP65的非关键结构域中,再构建于真核质粒pcDNA3.1,获得以HSP65为基因载体的含四个表位的多表位基因疫苗pHSP65pep,该疫苗经肌肉注射免疫可诱导特异性脾脏IFN-y+Thl细胞免疫和HSP65特异性血清IgG,具有一定的抗结核免疫保护作用（Vaccine2009;27:5313-19; Microbil Immunol.2009;53（10）:541-9）。然而,该疫苗还存在两个不足之处,首先,我们观察到免疫三个月后部分小鼠出现膝关节肿胀的自身免疫病症状,与少数报道相符,其原因与结核HSP65蛋白与哺乳动物关节软骨糖蛋白具有交叉抗原成分有关。因此有必要对基因疫苗的载体HSP65进行适当改造,使诱导自身免疫的危险降低。点突变与缺失改造的主要靶序列确定为HSP65蛋白的第180-188aa基序。其次,该疫苗仅能诱导全身性（systemic immunity）免疫应答,而不能诱导黏膜免疫（mucosal immunity）。新近研究提示：结核特异性Thl细胞在肺黏膜的募集和激活才是疫苗保护的关键。滴鼻免疫是诱导肺黏膜免疫的最佳免疫方式,但黏膜微环境容易降解抗原,因此选择优良的黏膜递送介质是诱导肺黏膜免疫的关键。来源于几丁质（chitin）的天然生物多糖壳聚糖（chitosan）及其寡聚体一壳寡糖（chitosan oligosaccharides, COS）系阳离子多聚物,因其无毒、缓释、促进黏膜吸附吸收等特性,成为黏膜递送载体的良好候选。Chitosan和COS与DNA共聚可形成纳米级均一复合物颗粒,不仅有助于黏膜缓释,还利于黏膜M细胞的摄取从而增强抗原提呈。特别是COS,具有水溶性、低粘度和低分子量特性,更有助于制备多糖-DNA多聚复合物。因此我们采用chitosan（壳聚糖）、COS（壳寡糖）与上述经改造的多表位基因疫苗共聚形成结核黏膜基因疫苗,经滴鼻免疫,以诱导的肺淋巴细胞中IFN-y+T细胞比例和肺灌洗液SIgA水平来评价其黏膜免疫效果；以脾淋巴细胞中IFN-γ+T细胞比例和血清IgG抗体效价评价其全身免疫效果；然后以大剂量BCG攻毒评价免疫保护效果。探讨肺黏膜免疫的诱导在抗结核免疫保护中的意义。进一步,我们采用BCG初免-结核黏膜基因疫苗滴鼻加强免疫的策略,再次证实结核黏膜基因疫苗配合全民已接种的BCG免疫后的免疫保护效果。获得以下主要结果：一、结核多表位基因疫苗载体（HSP65）的改造及其免疫学特性研究1)根据文献提示：HSP65蛋白第180-188aa中含有自身免疫原性相关表位。于是对第二位的苯丙氨酸（Phe）、第五位的谷氨酰胺（Gln）和第八位的亮氨酸（Leu）分别予以点突变；同时对180-188aa整段缺失。针对pHSP65和pHSP65pep,分别得到4种突变质粒,mutant-1（第二位Phe突变Ala）、mutant-2（第五位Gln突变Ala）、mutant-3（第八位Leu突变Ala）及mutant-4（整段缺失）。2)将上述不同载体改造的质粒,以未改造的pHSP65pep、pHSP65质粒为对照,分别于0、2、4、6周肌肉注射免疫雌性BALB/c小鼠,每次50μg/只,每组10只小鼠,共4次。3)检测所改造质粒的结核特异性免疫原性,发现：与未经改造的pHSP65pep结核基因疫苗相比,mutant-3和4诱导的结核特异性IFN-γ+CD4+Th1细胞免疫应答均无显著降低；而mutant-1和2诱导的T细胞应答低于未改造基因疫苗。提示：对载体HSP65蛋白第180-188aa的mutant-3和4的改造,不会影响HSP65载体的免疫原性及所含表位的免疫原性。4)检测各改造质粒免疫小鼠可能诱导的自身免疫应答和病理,发现：免疫3个月后,未经改造的pHSP65质粒免疫的部分小鼠膝关节出现轻度红肿,血清抗dsDNA抗体有所升高,肾脏和关节病理HE染色及免疫复合物沉积试验发现：原始pHSP65质粒具有诱导轻微肾小球肾炎潜能；而各改造质粒均未出现大体和病理异常,特别是mutant-4质粒,与正常小鼠的肾脏、关节组织病理无异。提示：对于载体HSP65蛋白第180-188aa的点突变或缺失改造,使以该载体为基础的结核基因疫苗诱导自身免疫应答的潜能降至最低,而其诱导结核特异性Thl免疫的能力不变,因此得到显著改良。5)综合结核特异性免疫和自身免疫结果,选择HSP65蛋白第180-188aa完全缺失突变质粒作为后续实验中多表位结核黏膜基因疫苗,为简洁,仍使用pHSP65pep字样代表。6)利用PET-32a（+）系统,体外表达并纯化得到大量HSP65蛋白。经WesternBlot鉴定为有活性的HSP65蛋白。二、壳寡糖组装结核黏膜基因疫苗的理化性质及其免疫原性和抗结核免疫保护特性研究为了诱导结核特异性黏膜免疫,采用两种来源于几丁质的天然生物多糖,壳聚糖（chitosan）和壳寡糖（COS）,分别与质粒DNA通过共凝聚法制备了chi-DNA和COS-DNA复合物颗粒疫苗。研究了其理化特性以及在小鼠体内的免疫原性和免疫保护特性。1)以0.02%的chitosan溶液在酸性条件、0.4%的COS溶液在中性条件,分别与质粒DNA复合形成chitosan-DNA（简称chi-DNA）和COS-DNA复合物颗粒。经扫描电镜和动态光散射证实为大小均一的球形颗粒,前者颗粒直径约200-400nm,后者直径约300-500nm。2)以琼脂糖凝胶电泳实验检测两种多糖对DNA的保护效果,发现DNA与壳聚糖或壳寡糖形成紧密大分子复合物,无法在电场中泳动而留在加样孔中。以高浓度DNase I消化裸露质粒DNA很快被降解；而chi-DNA、COS-DNA中的DNA仍完好无损；如先以高浓度的chitosanase酶解多糖,使DNA被释放,再加入DNase I, DNA可被降解。提示chitosan和COS均能保护DNA免受酶解。3)体外,以pGL3-Control荧光质粒为报告基因,以chi-DNA、COS-DNA、DNA分别转染293T细胞,检测荧光表达强度,发现：与裸露质粒DNA相比,两种黏膜介质均可显著促进报告基因的细胞表达,COS效果好于chitosan。4)以chi-DNA、COS-DNA结核黏膜基因疫苗与裸露DNA疫苗分别于0、2、4、6周滴鼻免疫BALB/c小鼠,每次50μg,共4次,BCG皮下注射为对照。5)与裸露基因疫苗相比,黏膜基因疫苗滴鼻免疫诱导了相当水平的全身性免疫,即高水平血清IgG和脾脏Thl免疫。在血清IgG方面,COS-DNA和chi-DNA均诱导了较高水平的血清IgG,效价分别为15000和12000,与裸露结核基因疫苗诱导的IgG效价类似（12000）,但低于BCG（320000）,其诱导的IgG类别均为IgG2a。在脾脏Thl细胞应答的诱导方面,COS-pHSP65pep与chi-pHSP65pep诱导的Thl细胞比例分别为2.88%和2.53%,显著高于裸露质粒DNA的1.22%和BCG组的0.85%。提示黏膜基因疫苗仍旧可诱导良好的全身性免疫应答。6)黏膜免疫应答的诱导主要表现为肺灌洗液SIgA和肺内Thl型免疫应答。在肺灌洗液SIgA方面,仅有天然多糖COS和chitosan组装的结核基因疫苗诱导了高水平的SIgA,效价分别为1500和1000；裸露质粒组诱导的SIgA效价低于200。而与chitosan相比,COS更为显著地促进了HSP65特异性SIgA抗体亲和力成熟。提示黏膜递送系统组装基因疫苗才能使其具有诱导特异性黏膜抗体的能力,且壳寡糖（COS）具有比壳聚糖（chitosan）更好的诱导SIgA能力。7)在诱导肺黏膜特异性T细胞免疫应答方面,即肺黏膜IFN-y+Th1和CTL应答方面,首先,胞内染色结果发现：COS-pHSP65pep诱导的肺脏Th1和CTL细胞比值为4.53%和7.25%,显著高于裸露DNA组的1.75%（Th1）、2.68%（CTL）和BCG组的2.05%（Th1）、3.41%（CTL）,略高于chi-pHSP65pep的3.87%（Th1）和5.13%（CTL）。其次,ELISPOT结果显示：与DNA和BCG组相比,COS-DNA和chi-DNA显著增加肺内IFN-γ+Th1细胞数量,分别为220/120SFC/106细胞,相比COS-DNA效果更为显著。提示滴鼻给予COS-DNA最为显著地促进了全身及黏膜部位Thl型免疫应答的产生。8)经大剂量BCG攻毒后4周,检测结核黏膜基因疫苗的免疫保护效果。发现：①不免疫小鼠攻毒后产生了严重的肺部炎症灶和组织损伤,提示肺结核的产生。②各免疫组相比,裸露结核基因疫苗滴鼻免疫的保护效果有限,肺脏中可见明显炎性病灶,肺泡结构有扩张性改变；而经COS和chitosan递送的黏膜基因疫苗的免疫保护显著增强,特别是COS-pHSP65pep组,仅发现极小炎症灶和肺泡上皮组织增厚。③肺脏和脾脏菌落计数提示：对照组的脾、肺结核杆菌数达到105CFU；裸露结核基因疫苗免疫组小鼠的肺脏和脾脏中,仍有103数量级的结核杆菌；chitosan组装结核基因疫苗组脏器细菌数降至101数量级；而经COS组装结核基因疫苗组脏器细菌数降至几乎检测不到。提示黏膜结核多表位基因疫苗滴鼻免疫可使肺、脾脏的结核杆菌数量降低4个数量级。免疫病理和菌落计数结果强烈提示：结核多表位基因疫苗pHSP65pep具有一定免疫保护效果；而以COS黏膜递送系统进行黏膜递送后,因显著增强了肺黏膜免疫T细胞和抗体应答,从而显著增强了抗结核免疫保护效果。三、BCG初免-壳寡糖组装结核黏膜基因疫苗加强免疫策略的抗结核保护研究基于我国普遍计划接种BCG的事实,在应用方面,研究BCG初免（prime）-黏膜基因疫苗加强（boost）免疫策略将更具有现实意义。1) BALB/c小鼠0周时行皮下初次免疫1×104CFU BCG,再以chi-DNA、 COS-DNA复合物颗粒和裸露DNA疫苗分别于2、4、6周滴鼻加强免疫3次,每次质粒50μg,1×104CFU BCG皮下注射4次组作为阳性对照。2)在血清IgG水平方面：与前次免疫相比,BCG初免-结核黏膜基因疫苗加强策略显著增强了HSP65特异性血清IgG水平,效价均有显著提高,COS-DNA组和chitosan-DNA组分别诱导了效价达120000的IgG,高于裸露质粒DNA加强免疫诱导的IgG（50000）。IgG亚类仍以IgG2a为主。3)在全身T细胞应答方面：COS-pHSP65pep组脾脏CD4+IFN-γ+T和CD8+IFN-γ+T细胞比例相对各组最高,为2.15%和1.57%,显著高于其他各组（p<0.05）。提示该策略在脾脏中诱导Thl型细胞应答为主,CTL应答不明显。4)在肺灌洗液SIgA诱导方面：COS-DNA疫苗加强免疫诱导的SIgA效价为1300,显著高于chitosan-DNA疫苗诱导的700；而裸露DNA疫苗加强免疫未能诱导肺灌洗液SIgA,提示COS在增强黏膜抗体应答方面的优势。5)肺黏膜T细胞应答方面：COS-pHSP65pep组诱导了9.32%的CD4+IFN-γ+Th1,显著高于裸露基因疫苗和BCG组的6.43%和5.68%（p<0.001）,同时,其诱导的肺内CTL细胞比例为9.65%,与chitosan-DNA组结果类似,而显著高于pHSP65组的6.78%（p<0.05）,提示BCG初免后COS仍然能够显著增加pHSP65基因疫苗诱导原本难以诱导的肺淋巴细胞Th1和CTL比例。6)经BCG攻毒后,发现：经COS和chitosan递送的黏膜基因疫苗的免疫保护显著增强,特别是COS-pHSP65pep组,仅发现极小炎症灶和肺泡上皮组织增厚。菌落计数提示：对照组的脾、肺结核杆菌数达到105CFU:chitosan组装结核基因疫苗组脏器细菌数降至101数量级；而COS组装结核基因疫苗免疫组脏器细菌数降至100。提示BCG初免-chitosan/COS黏膜结核基因疫苗加强策略,显著增强了结核基因疫苗的免疫保护功能。本研究在免疫所前期自主构建的结核多表位基因疫苗pHSP65pep勺基础上,在两方面进行了优化。首先,对其具有一定自身免疫原性的载体HSP65载体蛋白进行了缺失突变改造,保留其诱导结核特异性免疫应答能力,但降低了其诱导自身免疫的可能。其次,为更好地诱导肺内黏膜免疫,以早期清除肺内结核分枝杆菌,采用两种黏膜递送载体介质：壳聚糖（chitosan）、壳寡糖（COS）与改造后的结核黏膜基因疫苗,组装成为具有纳米颗粒特性的结核黏膜基因疫苗chitosan-pHSP65pep和COS-pHSP65pep。经滴鼻免疫,证实上述两种结核黏膜基因疫苗在保留诱导全身性免疫应答（血清IgG、脾脏T细胞应答）的基础上,均可显著增强特异性肺黏膜免疫应答,包括裸露基因疫苗难以诱导的肺灌洗液SIgA,和良好水平的肺淋巴细胞IFN-γ+Th1应答。其中,壳寡糖具有比壳聚糖更为显著的增强黏膜免疫应答的能力。经攻毒评估保护效果发现：两种结核黏膜基因疫苗均可增强抗结核保护,特别是COS-DNA黏膜基因疫苗,发挥了最好的免疫保护能力。最后采用BCG初免-黏膜基因疫苗加强策略,进一步证实了结核黏膜基因疫苗增强黏膜免疫和增强抗结核免疫保护效果的作用。我们的研究,以诱导肺黏膜免疫为疫苗研制出发点,创新性地采用两种几丁质来源的天然阳离子生物多糖,与基因疫苗复合形成结核黏膜基因疫苗,证实壳寡糖（COS）组装的结核黏膜基因疫苗具有优良的增强肺内黏膜免疫应答的能力；同时提示：肺内黏膜免疫的诱导是抗结核免疫保护的关键,具有重要的意义。本研究为新型结核疫苗的分子设计和结核病防治提供了新的思路和技术平台。