UTRN与肺癌细胞恶性转化关系的研究

论文摘要

前期的研究工作表明,Utrophin（UTRN）是一个候选的抑癌基因,它在乳腺癌、肾癌、肝癌等多种肿瘤中表达明显下调或缺失。为了进一步研究UTRN在肺癌细胞系的表达和定位情况,本研究利用半定量RT-PCR方法检测了UTRN的表达,结果表明在15种肺癌细胞系中UTRN呈不同程度的表达下调,其中4种存在UTRN cDNA 7909bp-10277bp处的表达缺失,6种在此区域表达明显下降。同时应用Western blotting技术,对UTRN蛋白进行了定位分析,结果发现UTRN在肺癌细胞系A549、AGZY-83a和Anip973的细胞核中存在约130 kD的截短蛋白（全长UTRN蛋白约为395 kD）。此外,应用免疫荧光技术,与人胚肺细胞MRC-5比较,在肺癌细胞系A549中可见细胞核区域存在UTRN的表达。综合分析以上研究结果,提示UTRN在肺癌细胞中不仅仅是表达缺失或表达降低,还存在着UTRN蛋白的转位和截短。为了进一步明确UTRN基因对细胞增殖和细胞骨架的影响,本实验以易转化、间变型小鼠成纤维细胞NIH3T3为材料,采用RNAi技术进行UTRN基因的表达沉默分析。通过绘制细胞增殖曲线和鬼笔环肽荧光染色方法,发现UTRN基因表达沉默后,与对照组比较,细胞增殖速度明显增加;微丝细胞骨架数量明显减少、结构紊乱,且细胞表面出现丝足。这些结果与我们前期以人胚肾HEK293细胞为材料进行的RNA干扰实验结果相一致。以上实验数据进一步揭示了UTRN基因作为抑癌基因在细胞内行使功能,为深入探讨UTRN与肿瘤发生的关系提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 肿瘤的基本概况
• 1.1.1 癌基因
• 1.1.2 抑癌基因
• 1.2 UTRN概述
• 1.2.1 UTRN基因和蛋白结构
• 1.2.2 UTRN基因的启动子和转录调节
• 1.2.3 UTRN蛋白的分布和功能
• 1.3 RNAi概述
• 1.3.1 RNAi的作用机制
• 1.3.2 RNAi的应用
• 1.4 课题来源及研究的目的和意义
• 1.4.1 课题来源及前期工作基础
• 1.4.2 研究的目的及意义
• 第2章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 细胞系
• 2.1.3 肺癌细胞系的RNA样品
• 2.1.4 质粒载体
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 缓冲液及其他溶液
• 2.1.7 培养基及相关溶液
• 2.1.8 实验中的相关引物及siRNA序列
• 2.1.9 主要实验仪器
• 2.1.10 主要软件
• 2.2 方法
• 2.2.1 UTRN在肺癌细胞系中的表达
• 2.2.2 UTRN在肺癌细胞中的定位
• 2.2.3 siRNA的设计
• TM 4.1-CMV neo vectors表达载体的构建'>2.2.4 siRNA-pSilencer^TM 4.1-CMV neo vectors表达载体的构建
• 2.2.5 siRNA稳定转染NIH3T3 细胞及转染细胞的筛选
• 2.2.6 RNAi对UTRN基因封闭效果的半定量RT-PCR检测
• 2.2.7 siRNA抑制UTRN基因表达对细胞增殖能力的影响
• 2.2.8 siRNA抑制UTRN基因表达对细胞微丝骨架F-actin的影响
• 2.2.9 本章小结
• 第3章 UTRN在肺癌细胞系中的表达定位分析
• 3.1 全长UTRN在肺癌细胞系中的扩增结果
• 3.2 UTRN蛋白在肺癌细胞系中的定位分析
• 3.2.1 UTRN蛋白的Western blotting定位结果
• 3.2.2 UTRN蛋白在肺癌细胞系A549 中的免疫荧光定位结果
• 3.3 UTRN基因表达降低或缺失与肿瘤发生的关系
• 3.4 UTRN截短蛋白的核转位与肿瘤发生的关系
• 3.5 本章小结
• 第4章 RNAi分析UTRN的细胞生物学作用
• 4.1 RNAi沉默NIH3T3 细胞系UTRN基因表达效果分析
• 4.1.1 siRNA的设计
• TM 4.1-CMV neo vectors的构建和确认'>4.1.2 siRNA-pSilencer^TM 4.1-CMV neo vectors的构建和确认
• 4.1.3 重组体的大量制备、质量检测及浓度测定
• 4.1.4 稳定转染siRNA重组体的NIH3T3 细胞系的获得
• 4.1.5 半定量RT-PCR方法检验siRNA封闭UTRN基因表达的效果
• 4.2 UTRN的细胞生物学功能分析
• 4.2.1 UTRN基因表达降低后细胞增殖能力的变化
• 4.2.2 UTRN基因表达降低后细胞骨架微丝的变化
• 4.3 UTRN对细胞增殖能力的影响
• 4.4 UTRN对细胞骨架微丝的影响
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 1 pSilencer 重组子测序结果图
• 附录 2 增殖曲线计数数据
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢