普通烟草K+通道NKT5的克隆、序列分析及转基因载体的构建

论文摘要

钾素对烟草的产量和品质有着重要的作用。提高烟草中的钾含量能提高烟草的抗逆能力。K+通道是烟草吸收K+的主要途径。本文采用RACE的方法从普通烟草中克隆得到K+通道基因NKT5,对NKT5进行序列分析和生物信息学分析;并构建了NKT5的转基因载体,为后续研究提供技术支持和理论基础。本研究运用已经获得的1条490bp的普通烟草K+通道基因的中间片段来设计特异性引物,应用RACE方法获得3’末端和5’末端cDNA序列。通过三段cDNA序列拼接结合及全长克隆测序验证,获得一个未报道的普通烟草K+通道基因,并将其命名为NKT5（NCBI登录号为HM010922）。NKT5的cDNA全长为2365bp,其中5’非编码区190bp、3’非编码区249bp、编码区1926bp,编码641AA。通过NKT5的结构保守域、蛋白跨膜区及蛋白质空间结构的分析,得出关于K+通道基因NKT5的相关生物信息学的分析;并构建了烟草、拟南芥及相关植物K+通道的系统进化树。对该基因进行了序列分析及功能预测,为进一步阐明烟草K+通道基因NKT5在烟草吸钾、抗逆过程中的分子机制,以及研究烟草K+通道基因的功能表达等奠定基础。以K+通道基因NKT5的核苷酸序列为模板,设计带有酶切位点的特异性引物,通过RT-PCR的方法,从普通烟草中克隆到全长的NKT5基因,测序分析与已经报道的NKT5基因序列一致。然后将其构建到经过酶切处理后的植物表达载体pCAMBIA1300、pCAMBIA1302上,经过连接转化、PCR及酶切鉴定表明转基因表达载体构建成功,接下来可以转化到农杆菌中,用于后续的转基因的试验,来进一步揭示烟草K+的吸收特性和抗逆机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 烟草类型及钾素抗逆性概述
• 1.1.1 烟草的类型及其主要特点
• 1.1.2 钾素对普通烟草烟叶品质及其抗逆性的影响
• +通道及转基因烟草抗逆性的研究进展'>1.2 烟草K⁺通道及转基因烟草抗逆性的研究进展
• +通道的概况'>1.2.1 K⁺通道的概况
• 1.2.2 转基因烟草的研究
• 1.3 研究的目的、意义、主要内容
• 1.3.1 研究目的
• 1.3.2 研究意义
• 1.3.3 主要内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 试验主要仪器
• 2.1.3 试验试剂及药品
• 2.2 试验设计与方法
• 2.2.1 RNA 的提取
• 2.2.2 PCR 产物的检测
• 2.2.3 反转录
• 2.2.4 RACE
• 2.2.5 全长序列扩增
• 2.2.6 目的基因的扩增
• 2.2.7 PCR 产物的回收
• 2.2.8 PCR 产物的连接及测序
• 2.2.9 质粒DNA 的提取
• 2.2.10 载体pMD18-T 插入NKT5 DNA 片段的双酶切鉴定
• 2.2.11 载体的选择及活化
• 2.2.12 载体与目的基因的连接及产物鉴定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 RNA 的提取与反转录第一链检测
• 3.2 NKT5 末端序列的扩增及NKT5 序列的分析
• 3.2.1 NKT5 的3’RACE 扩增
• 3.2.2 NKT5 的3’RACE 序列分析
• 3.2.3 NKT5 的5’RACE 序列的扩增
• 3.2.4 NKT5 的5’RACE 序列分析
• 3.3 NKT5 的全长序列的获得与分析
• 3.3.1 NKT5 的全长序列的获得
• 3.3.2 NKT5 基因全长序列分析
• 3.4 NKT5 的生物信息学分析
• 3.4.1 NKT5 的保守结构域分析
• 3.4.2 NKT5 蛋白的跨膜分析
• 3.4.3 NKT5 蛋白的二级结构分析
• 3.4.4 NKT5 蛋白的三级结构分析
• 3.4.5 NKT5 的系统进化树分析
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• +通道基因NKT5 的克隆'>4.1.1 烟草K⁺通道基因NKT5 的克隆
• 4.1.2 NKT5 的序列分析及功能预测
• 4.1.3 NKT5 转基因载体的构建
• 4.2 讨论
• 4.2.1 扩增NKT5 基因的引物设计及NKT5 基因的克隆
• 4.2.2 烟草NKT5 具有的Shaker 家族的结构特征
• 4.2.3 NKT5 基因克隆酶切位点的设计
• 4.2.4 载体选择、载体与目的基因的连接
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历