费氏中华根瘤菌WGF03的cysDN基因克隆及其相关功能的研究

论文摘要

硫与根瘤菌的结瘤以及固氮有较为密切的联系,现代研究早已证明根瘤菌结瘤因子还原性末端的硫化修饰决定了根瘤菌的宿主专一性,并且胞外多糖的硫化修饰也与根瘤菌的结瘤固氮有关联。本工作的目的就是通过突变的方式获得与硫酸盐同化途径相关的基因,分别构建其同源单交换的突变株,进而进行功能互补,研究这些基因对菌株生长以及对共生结瘤固氮的影响,从而揭示硫代谢基因在根瘤菌与豆科植物共生过程中的作用。本工作是利用质粒转座子pTnMod-RKm’随机插入费氏中华根瘤菌WGF03基因组中构建突变体席,随后用含有四种不同硫源的MM筛选培养基筛选有关硫酸盐同化途径的缺陷突变体。如果在此途径中的某个基因被破坏的情况下,则此突变体在含有上游硫源的MM培养基中就不能生长或牛长不良,在含有下游硫源的MM培养基中能够正常生长。经过筛选最终获得一个与硫酸盐同化途径密切相关的操纵子——cysDN,通过牛物信息学分析发现与＆norhizobium sp.BR816的cysDN在核苷酸水平上有92%的同源性,在氨基酸水平上有96%的相似性,与Rhizobium tropici的cysH,cysD,cysN基因有83%的同源性。利用pK18mob自杀质粒分别构建cysD和cysN的同源单交换突变体,获得突变株cysDF/WGF03, cysDR/WGF03, cysNF/WGF03, cysNR/WGF03。之后用pLAFRJ质粒与完整的操纵子cysDN连接获得互补质粒cysDN+pLAFRJ,将之导入四种突变体中,经过验证得到互补菌株HcysDF/WGF03, HcysDR/WGF03, HcysNF/WGF03, HcysNR/WGF03。通过对出发菌株,突变菌株,互补菌株在不同硫源的MM培养基中的生长状况的测试,发现突变菌株不能在硫酸盐为唯一硫源的MM培养基中生长,而出发菌株和互补菌株均在硫酸盐为唯一硫源的MM培养基中生长良好,三者在其它无机硫源和有机硫源中生长状况相差不大。这说明互补菌株能够将弥补突变菌株缺失的功能。植株试验表明,突变菌株的最初现瘤时间比出发菌株推迟1-2天,在竞争结瘤方面,将突变菌株与出发菌株等量接种后发现出发菌株占瘤率为70%,而突变菌株仅占30%,这说明操纵子cysDN的突变影响了根瘤菌的竞争结瘤能力。突变菌株和出发菌株在植株平均结瘤数目,平均瘤重,平均植株干重方面相差无几,但突变株cysDF/WGF03, cysDR/WGF03, cysNF/WGF03, cysNR/WGF03在固氮酶活上低于出发菌株WGF03,这农明此操纵子与根瘤菌WGF03的固氮酶活有一定的关系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 共生固氮与根瘤菌
• 1.2.1 根瘤菌系统发育与分类
• 1.2.2 共生体的形成
• 1.2.3 共生固氮生理学
• 1.3 微生物的硫代谢
• 1.3.1 微生物无机硫的同化
• 1.3.2 微生物硫代谢的研究趋势及其进展
• 1.3.3 根瘤菌的硫代谢
• 1.4 本课题研究的背景、意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 菌株与质粒
• 2.2 培养基,抗生素与菌株生长条件
• 2.3 试剂,溶液和缓冲液
• 2.4 根瘤菌总DNA的提取
• 2.5 质粒DNA的制备
• 2.6 DNA片段的分离与回收
• 2.7 DNA片段的纯化
• 2.8 琼脂糖凝胶电泳
• 2.9 DNA的酶切
• 2.10 连接与转化
• 2.11 PCR（聚合酶链式反应）扩增DNA
• 2.12 三亲本接合
• 2.13 利用质粒转座子pTnMod-Rkm'构建突变体库
• 2.13.1 质粒转座子pTnMod-Rkm'简介
• 2.13.2 突变体库的构建
• 2.14 同源单交换突变体的形成及其互补菌株的构建
• 2.15 植株试验
• 2.16 cysDN在GenBank的登录号
• 第三章 S.Fredii WGF03突变体库的构建及突变体的筛选
• 3.1 引言
• 3.2 WGF03突变体库的建立
• 3.2.1 三亲接合随机插入突变WGF03
• 3.2.2 突变体的验证
• 3.3 硫酸盐同化途径突变体的筛选
• 3.4 讨论
• 第四章 突变体基因的克隆及生物信息学分析
• 4.1 突变体基因的克隆
• 4.1.1 突变株总DNA的提取
• 4.1.2 突变株105.26基因组DNA与pMD-18T克隆载体的BamHⅠ酶切
• 4.1.3 连接与转化
• 第五章 突变体的构建与分析
• 5.1 前言
• 5.2 同源单交换重组质粒的构建
• 5.2.1 各个ORF部分片段的克隆
• 5.2.2 将pK18mob自杀质粒用SmmaI酶切
• 5.2.3 部分片段与pK18mob的连接与转化
• 5.2.4 连接片段正反向验证
• 5.3 WGF03同源单交换突变体的构建及验证
• 5.3.1 三亲本接合及突变体筛选
• 5.3.2 突变体的验证
• 第六章 互补菌株的构建和植株试验
• 6.1 前言
• 6.1.1 利用三亲本接合法构建互补菌株
• 6.1.2 互补菌株的验证
• 6.2 出发菌株,突变菌株,互补菌株的生长状况
• 6.2.1 WGF03, cysDF/WGF03, cysDR/WGF03, HcysDF/WGF03,HcysDR/WGF03利用无机硫源生长状况
• 6.2.2 WGF03, cysDF/WGF03, cysDR/WGF03, HcysDF/WGF03,HcysDR/WGF03利用有机硫源生长状况
• 6.2.3 WGF03, cysNF/WGF03, cysNR/WGF03, HcysNF/WGF03,HcysNR/WGF03利用无机硫源生长状况
• 6.2.4 WGF03, cysNF/WGF03, cysNR/WGF03, HcysNF/WGF03,HcysNR/WGF03利用有机硫源生长状况
• 6.3 植株试验
• 6.3.1 植株的结瘤动力学测定
• 6.3.2 竞争结瘤检测
• 6.3.3 共生结瘤固氮效应检测
• 第七章 结果与讨论
• 7.1 实验结果
• 7.2 讨论
• 7.3 本工作后续研究
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文