论文摘要
高盐、干旱和低温等非生物胁迫是影响植物生长和作物生产的较为广泛的不利生境,运用基因工程方法培育抗性品种是重要的抗逆生物学途径。在植物的胁迫应答中,基因的表达调控起着重要的作用。植物中存在大量胁迫相关的基因,当受到某一环境因素的胁迫时,植物会调节这些胁迫相关基因的表达,产生相应的适应性。目前已有许多胁迫相关基因被克隆,并被用于植物抗逆基因工程中,得到了一些有一定抗逆能力的转基因植株。但在基因工程实践中常用来控制目的基因表达的启动子主要是CaMV35S 启动子,该启动子可使目的基因过量表达,但它是无环境、组织和时间特异性的组成型的表达。利用组成型表达启动子控制抗性相关基因的过量表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力,但正常环境条件下细胞内组成型过量表达抗逆蛋白则是一种能量浪费,且正常环境下细胞内的抗逆蛋白长时间过量的积累可能妨碍植物的正常生长代谢,引起植物的形态发生改变,造成转基因植物生长发育严重停滞甚。解决此矛盾,可以用逆境胁迫专一诱导的启动子,但目前鉴定的胁迫诱导启动子的活性仍不满足要求。本实验意在摸索人工构建受多种胁迫强诱导的启动子。目前已有许多环境胁迫诱导的基因及其启动子被克隆,且有些启动子已被详细研究,确定了这些启动子行使其功能的关键片段,并鉴定了一系列与转录因子相互作用的顺式作用元件,如干旱应答元件DRE,ABA 应答元件ABRE,光应答元件G-box 等。本实验从已发表的论文中获得了rd29A、erd1、cor15a、lti30、kin1 五个胁迫诱导基因的启动子序列,这五个启动子均受多种胁迫诱导,它们均含有多个胁迫应答元件。本实验用PCR 方法从这五个胁迫诱导启动子上分别获取了它们的关键片段,由于rd29A 启动子是目前常用的诱导活性较高的启动子,本实验以rd29A 启动子上的关键片段到其ATG 后15bp 的269bp 片段MP 为基础,在其5’端依次连接其它关键片段的单体或二聚体,构建了六条人工嵌合启动子,分别为erd1+kin1+cor15a+MP、lti30+erd1+kin1+cor15a+MP、erd1+kin1+cor15a+lti30+MP、erd1+kin1+cor15a+rd29A+MP、erd1+cor15a+cor15a+rd29A+MP、erd1+erd1+cor15a+rd29A+MP。又克隆了rd29A 全长启动子作为对照。选用pBI121 作为植物表达载体,该载体上有由CaMV35S 启动子调控的Gus 基因。将这六条人工构建的嵌合启动子和rd29A 全长启动子分别取代pBI121 上的CaMV35S 启动子,使它们控制位于其后的Gus 基因的表达。pBI121 载体和重组表达载体分别导入农杆菌GV3101,转化拟南芥愈伤组织,冷处理后瞬时表达分析表明这些重组启动子均具有诱导活性。这些载体导入农杆菌