论文摘要
干细胞是一类具有自我增殖能力和分化潜能的细胞,在特定的条件下可以分化为不同的功能细胞,甚至形成多种组织和器官。间充质干细胞（MSCs）因其具有多向分化潜能,取材方便,增殖能力强,易于在体外大量培养扩增等特点,成为理想的组织工程种子细胞,在促进创伤组织修复中具有较大科研价值和广阔的应用前景。针对目前异体肝移植存在供肝严重不足,手术及维持费用昂贵,手术风险大,以及移植由于免疫排斥的发生而导致供肝功能丧失等缺点,人们期望通过利用MSCs治疗来解决肝移植带来的这些问题。但目前文献报道有关MSCs在体内能否分化为肝细胞仍存在很大争议,另外,目前研究和应用多采用体外分离培养的MSCs或经诱导后的MSCs经门静脉、脾静脉、肝内等途径移植,但这类方法所移植的细胞因为体内外环境的差异,其生物学性状、行为往往发生改变,因此寻求更有效安全的利用MSCs的方法成为目前研究的一个重点。本课题组前期研究发现,小鼠10Gy全身照射后,经尾静脉移植的骨髓单个核细胞（包括MSC和HSC）能够定植在外周血、骨髓、肠道、肝脏、脾脏、骨骼肌、脑等多种组织。在此基础上,本研究以GFP转基因小鼠骨髓单个核细胞建立骨髓嵌合小鼠模型,并观察了骨髓单个核细胞在肝内的分化,为了进一步明确MSCs在体内能否分化为肝细胞,我们以丙烯醇致肝损伤进行MSCs肝局部移植,以观察外源性移植的MSCs在肝内的分化。GFP基因是一种标记基因,该基因表达后产生的绿色荧光蛋白在紫外光的激发下可发出明亮的绿光,因此利用GFP转基因小鼠的MSCs能够方便直观的追踪观察MSCs在体内的分化。结合文献报道以及本实验室前期研究结果提示,我们考虑能否利用干细胞动员这一体内方法促进肝损伤修复,因此我们培养、鉴定经G-CSF动员后大鼠外周血MSCs,此基础上我们观察了肝损伤后肝内与干细胞迁移动员相关的信号分子SDF-1的表达变化,探讨外周血MSCs如何迁移到肝脏,并检测其向肝细胞分化的能力,为利用MSCs动员促进肝损伤修复提供一定的试验依据。主要结果和结论:1.10Gy 60Coγ射线照射的小鼠移植GFP转基因小鼠骨髓单个核细胞后,造血重建,小鼠外周血白细胞和淋巴细胞数恢复,明显提高照射后小鼠的存活率,移植小鼠至今已存活16个月。2.骨髓嵌合小鼠模型肝内观察到移植来源的骨髓单个核细胞,细胞形态与周围肝细胞相似,免疫荧光双染结果显示此类细胞能够同时表达GFP和白蛋白,说明移植的骨髓单个核细胞在小鼠肝内能分化为具有分泌白蛋白功能的肝细胞。经局部移植的MSCs能够定植在肝脏,免疫荧光双染结果显示此类细胞能够同时表达GFP和白蛋白,说明移植的MSCs在小鼠肝内能分化为具有分泌白蛋白功能的肝细胞。3.骨髓嵌合小鼠模型肝内还观察到窦间隙内有多量的呈成纤维细胞样和内皮细胞样的GFP阳性细胞,这类细胞有可能是肝卵圆细胞、成纤维细胞或是肝窦内皮细胞,提示我们骨髓单个核细胞在肝内的分化是几种途径并存。4.经20μg/Kg G-CSF动员后外周血MSCs集落数量明显高于未动员组和10μg/Kg动员组,根据细胞形态和干细胞标志物检测证实利用G-CSF动员能够明显的提高外周血MSCs数量。5.肝损伤后肝组织内SDF-1mRNA和蛋白表达在伤后5d内持续升高,目前研究表明SDF-1与干细胞动员有密切关系,推测伤后肝内SDF-1表达上调,能够吸引外周血中MSCs归巢到肝脏参与损伤修复,但具体机制有待进一步研究。HGF+FGF-4和肝匀浆蛋白都能诱导外周血培养的MSCs分化为肝细胞样细胞。说明外周血内的MSCs具有分化为肝细胞,参与肝脏损伤修复的潜能。6.HGF+FGF-4和肝匀浆上清都能诱导外周血培养的MSCs分化为肝细胞样细胞。说明外周血内的MSCs具有分化为肝细胞,参与肝脏损伤修复的潜能。