异种脱细胞真皮基质微粒皮肤的构建及其相关实验研究

论文摘要

深度缺损创面的修复在烧烫伤、难治性皮肤溃疡、瘢痕整形等的治疗中有着重要意义。传统的治疗方法主要是移植自体皮或自体皮瓣,常常会出现供皮区色素沉积,瘢痕形成。当皮肤缺损面积较大时,自体皮还会供应不足。皮肤组织工程(TE)的发展与应用为改善创面修复质量,解决皮源短缺问题,提供了一条崭新的途径。近年来,脱细胞真皮基质(ADM)成为组织工程皮肤研究中最有前景的真皮支架材料之一,ADM修复皮肤粘膜缺损和进行软组织充填的有效性已经被动物实验和初期临床应用实验所证明,是一种较为理想的真皮替代物。由于同种异体ADM来源有限且受伦理限制,为此研究人员开发了猪的ADM。传统方法制备的异种ADM,抗原性明显强于同种异体ADM,移植后成活率降低且收缩明显,组织学研究证实组织中有广泛的炎症反应及胶原结构破坏。目前,异种ADM的制备方法还缺乏统一标准,主要有高渗盐水法、酶消化法、戊二醛交联法、去垢剂法、NaOH消蚀法、冻融法等。每种方法单独使用时都不能保证既充分去除所有的细胞和细胞碎片,又保证真皮结构完整,必须与其他方法联合应用方能获得较理想的ADM支架材料。另一方面,ADM移植后的血管化及营养成分渗透等问题的解决,对提高ADM支架的实用性有着重要的临床意义。本课题在现有ADM制备方法的基础上,制备一种新型异种ADM微粒,并利用成纤维细胞能够分泌多种细胞外基质、细胞因子和生长因子的特性,将成纤维细胞种植于异种ADM微粒上,探索构建ADM微粒皮肤的可行性;并将ADM微粒皮肤注射到SD大鼠皮下和移植到全层损伤模型,观察ADM微粒皮肤对软组织和创伤的修复能力,期望能够收获一种应用方便,适用范围广的组织工程微粒皮肤产品,并为规模化、商品化生产微粒皮肤奠定一个良好的基础。本实验的研究内容和结果如下:1.改良消蚀法制备异种脱细胞真皮基质微粒及其生物相容性评价应用机械法切除猪真皮乳头层,结合胰酶消化、NaOH消蚀法和冻融法除去网状真皮中的所有细胞,制备成ADM。将ADM切割成颗粒状,对ADM微粒做细胞毒性实验、细胞相容性实验、皮下埋藏实验和免疫组化实验检验其生物相容性。结果显示ADM微粒大小较均匀呈瓷白色,有弹性,韧性好,质地柔软;三维结构完整,胶原纤维稍松散但排列规则,相互交织成立体网状结构,孔隙较多并均匀;成纤维细胞在ADM微粒上生长较好,在材料上有数层细胞生长;无明显排异反应,组织相容性良好,血管和成纤维细胞长入快。2.异种ADM微粒皮肤的构建及其性能研究体外培养人成纤维细胞,用PKH26标记,将细胞与ADM微粒复合构建微粒皮肤,用荧光显微镜观察、电镜观察和MTT法检测组织工程微粒皮肤的性能。结果显示,种植第2天,成纤维细胞在ADM微粒上能够较好黏附,但增殖缓慢,之后细胞增殖明显加快,10天时达到增殖高峰。成纤维细胞能在ADM微粒上很好的生长,构建好的组织工程微粒皮肤上成纤维细胞呈多层生长,并分泌大量细胞外基质。3.异种ADM微粒皮肤皮下注射和SD大鼠全层皮肤损伤移植实验将带荧光的猪ADM微粒皮肤,注射到SD大鼠皮下,用荧光显微镜和HE观察ADM微粒真皮对皮下组织的修复;将SD大鼠随机分成3组,分别移植自体全厚皮肤、ADM微粒和ADM微粒皮皮肤。大体、荧光显微镜和HE观察伤口愈合情况、计算创面愈合时间和收缩率。结果显示ADM微粒皮下注射后一周可观察到红色荧光,提示种植的成纤维细胞具有活性。皮下注射ADM微粒皮肤8周时体积稳定,胶原排列整齐,成纤维细胞数目少并稳定,而单纯ADM微粒皮下注射12周时体积才稳定。皮肤移植修复全层皮肤损伤模型见:ADM微粒皮肤移植和ADM微粒移植相比,血管化加快,特别是移植早期;ADM微粒皮肤对创面的修复,其愈合时间与自体全厚皮肤移植相当(P﹥0.05),明显好于单纯ADM微粒移植(P﹤0.01);创面收缩情况,ADM微粒皮肤与自体全厚皮肤移植相比无统计学意义(P﹥0.05),与ADM微粒移植相比,差异显著(P﹤0.01)。综上所述,我们所制备的猪ADM微粒是一种新型、免疫原性低、生物相容性好的真皮支架材料,用于构建微粒皮肤具有实际可行性。体内动物实验表明这种ADM微粒通过皮下注射或创面移植均可有效促进创面愈合,修复缺损。有望在将来成为一种新型治疗途径扩展组织工程皮肤替代物的应用前景。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾一 组织工程皮肤的研究进展和临床应用
• 文献回顾二 脱细胞真皮基质的研究进展和临床应用
• 异种脱细胞基质微粒皮肤的构建及其相关实验研究
• 实验一 改良消蚀法制备异种脱细胞真皮基质微粒及其生物相容性评价
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 新型异种脱细胞真皮微粒的制备
• 2.2 成纤维细胞的分离培养、扩增、传代、冻存和复苏
• 2.3 细胞毒性实验
• 2.4 细胞相容性实验
• 2.5 动物皮下埋藏实验
• 2.6 ADM微粒免疫组化染色
• 3 结果
• 3.1 脱细胞真皮基质观察
• 3.2 培养的成纤维细胞观察
• 3.3 MTT检测结果
• 3.4 细胞相容性检测
• 3.5 皮下埋藏实验观察
• 3.6 免疫组化染色观察
• 4 讨论
• 实验二 异种ADM微粒皮肤的构建及其性能研究
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 PKH26标记成纤维细胞
• 2.2 组织工程微粒皮肤的构建
• 2.3 细胞增殖检测
• 2.4 统计学方法
• 3 结果
• 3.1 PKH26标记成纤维细胞观察
• 3.2 ADM微粒皮肤的细胞生长情况观察
• 3.3 ADM微粒皮肤的细胞增殖情况检测
• 4 讨论
• 实验三 异种ADM微粒皮肤皮下注射和皮肤移植对动物创伤愈合的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 ADM微粒皮肤的构建
• 2.2 ADM微粒皮肤皮下注射
• 2.3 皮肤移植物的准备
• 2.4 动物分组和移植
• 2.5 创面愈合情况的观察
• 2.6 统计学方法
• 3 结果
• 3.1 观察皮下注射ADM微粒皮肤对皮下组织修复的影响
• 3.2 皮肤移植后的大体观察
• 3.3 皮肤移植后的组织学观察
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢