MDA-7/IL-24选择性促进肝癌细胞凋亡和增殖阻滞及其机制研究

论文摘要

第一部分：携带MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建及表达鉴定目的：构建携带人MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒载体，观察其在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达，为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法：将人MDA-7／IL-24 cDNA定向克隆于腺病毒穿梭质粒pSGCMV，获得重组质粒pSGCMV-MDA-7，采用脂质体转染法将其与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞，通过细胞内同源重组，生成携带MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad.mda-7。并用其感染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、Hep3B以及正常的肝细胞L02，RT-PCR方法验证MDA-7／IL-24的表达，ELISA方法检测细胞培养上清中MDA-／IL-24蛋白的表达。结果：通过DNA测序和PT-PCR提示携带MDA-7／IL-24的复制缺陷型腺病毒构建成功，PT-PCR和ELISA方法提示该载体能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞和正常肝细胞中高效表达。结论：成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad.mda-7，该载体能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞和正常肝细胞中高效表达。第二部分Ad.mda-7选择性杀伤肝癌的体外研究目的利用构建的携带人MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒Ad.mda-7作为载体，感染肝癌细胞HepG2、SMMC7721、Hep3B、MHCC97L和M6和正常的肝细胞L02，观察该基因对肝癌的选择性杀伤作用，为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2、SMMC7721、Hep3B、MHCC97L和M6。通过RT-PCR方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，ELISA方法检测细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的浓度，四甲基偶氮哩蓝染色法（MTT）及Hoechst染色观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用，Annexin-Ⅴ和PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡，利用流式细胞仪检测细胞周期。结果RT-PCR提示复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、Hep3B、MHCC97L、M6和正常细胞L02中高效表达。ELISA方法检测提示细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达。MTT实验结果表明，MDA-7／IL-24能明显抑制各种肝癌细胞的生长，Hoechst染色提示MDA-7／IL-24促进肝癌细胞的凋亡，流式细胞仪提示MDA-7能选择性杀伤肝癌细胞而对正常的肝细胞没有影响，细胞周期分析提示MDA-7／IL-24阻滞肝癌细胞在G2／M期，同时对正常的肝细胞没有促凋亡作用和增殖阻滞作用。结论：复制缺陷型重组腺病毒载体Ad.mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞HepG2、SMMC7721、Hep3B、MHCC97L和M6，促进细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡而与肿瘤细胞的P53基因的状态无关，同时对正常的肝细胞L02没有任何毒性作用。第三部分Ad.mda-7选择性杀伤肝癌细胞的机理探讨目的探索携带MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒Ad.mda-7选择性杀伤肝癌细胞的机理，为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2。通过RT-PCR方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，ELISA方法检测细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的浓度，Western blot检测细胞内MDA-7／IL-24的表达，Hoechst染色观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用，Annexin-Ⅴ和PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡，利用线粒体分离试剂分离感染后0h、6h、12h和24h时段正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2的线粒体和胞浆蛋白，通过western blot方法检查胞浆和线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2家族和caspase9，线粒体释放的促凋亡蛋白CytochromeC和Smac／Diablo的变化。结果RT-PCR提示复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株HepG2和正常细胞L02中高效表达。ELISA方法检测提示细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达，蛋白电泳提示MDA-7蛋白在细胞内表达，而且随着时间的延长表达增强；Hoechst染色提示MDA-7／IL-24促进肝癌细胞的凋亡，流式细胞仪提示MDA-7能选择性杀伤肝癌细胞而对正常的肝细胞没有影响，通过RT-PCR和亚细胞蛋白的分析发现胞浆内抑制凋亡的物质Bcl-2和Bcl-xL表达在HepG2细胞中明显下降，而在L02中没有表达的下降，同时促凋亡蛋白Bax和在肝癌细胞中明显增强，Bak的表达没有明显的变化。同时促进细胞线粒体释放细胞色素C和Smac／Diablo，促进Caspase9的表达增强，从而导致肝癌细胞的凋亡。结论：复制缺陷型重组腺病毒载体Ad.mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞HepG2，诱导肿瘤细胞凋亡的机制与线粒体促凋亡物质的释放有关，同时对正常的肝细胞L02没有任何毒性作用。第四部分：重组腺病毒介导的MDA-7／IL-24和阿霉素联合治疗肝癌的动物实验研究目的：将重组腺病毒介导的mda-7／IL-24（melanoma differentiation-associated gene-7）和／或阿霉素（adriamycin，ADM）联合治疗裸鼠肝癌，探索基因治疗和化疗相结合治疗肿瘤的新方法。方法：构建携带人mda-7／IL-24的重组腺病毒载体（Ad.mda-7），单独用其或ADM以及两者联用对实验性肝癌裸鼠进行治疗，用RT-PCR和western blot检测肿瘤组织中mda-7的表达，用ELISA方法检测裸鼠血清内MDA-7／IL-24蛋白的浓度变化；并观察抗肿瘤效果。结果：（1）RT-PCR、western blot和ELISA方法可检测到Ad.mda-7+ADM组和Ad.mda-7组中mda-7表达明显增加。（2）Ad.mda-7+ADM组裸鼠肝癌生长抑制率最大值为70.4％，明显高于ADM组和Ad.mda-7组的35.9％和46.3％（P＜0.01）；（3）Ad.mda-7+ADM组裸鼠早期死亡率为0，明显低于ADM组的40％（P＜0.01）；Ad.mda-7+ADM组裸鼠长期生存率为80％，明显高于ADM组和Ad.mda-7组的40％（P＜0.01）。结论：腺病毒介导的mda-7能在体外活体中高表达；Ad.mda-7和ADM治疗裸鼠肝癌具有协同作用，Ad.mda-7可显著增强化疗效果，明显降低化疗不良反应。

论文目录

• 一、引言
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、正文
• 第一部分 携带人MDA-7/IL-24基因的非复制性腺病毒载体构建及表达鉴定
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 英文
• Abstract
• Introduction
• Materials and Methods
• Results
• Discussion
• References
• 第二部分 Ad.mda-7选择性杀伤肝癌的体外研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 英文
• Abstract
• Introduction
• 1.Materials and Methods
• 2.Results
• 3.Discussion
• References
• 第三部分 Ad.mda-7选择性杀伤肝癌细胞的机理探讨
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 第四部分 MDA-7/IL-24选择性杀伤肝癌的活体研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 五、文献综述
• 参考文献
• 六、博士生期间发表论文题录
• 七、致谢