苏云金芽胞杆菌杀线虫蛋白基因cry6Aa的表达负调控及杀线虫蛋白进入根结线虫体内的模式

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种在土壤中广泛分布的革兰氏阳性细菌,在芽胞形成期产生的晶体蛋白对许多昆虫有毒力,因而被广泛用作害虫的生物防治。近些年来发现其对线虫也有毒力。本文从苏云金芽胞杆菌对植物寄生线虫的防治效果、杀线虫晶体蛋白基因表达调控和晶体蛋白对植物寄生线虫的作用方式等方面研究了苏云金芽胞杆菌对植物寄生线虫的作用。1.测定了苏云金芽胞杆菌YBT-1532菌株对根结线虫毒力及防治效果。该菌株携带有编码130kDa晶体蛋白的杀线虫基因cry1Ea6,同时该菌株还产生丰富的苏云金素,也对线虫有很高的毒力。分别测定该菌株产生的晶体蛋白和苏云金素对北方根结线虫（Meloidogyne hapla）二期幼虫的毒力,发现它们都表现出了很高的毒力,其LC50分别为19.32μg/mL和25.87μg/mL。同时,我们还测定了在盆栽条件下该菌株对北方根结线虫的防治效果。结果显示,在盆栽条件下该菌株可以有效抑制北方根结线虫对番茄的感染、降低根组织上根结数量、产卵量以及土壤中的虫口密度。我们还进行了防治花生根结线虫（M.arenria）的田间初步实验,该菌株对花生根结线虫并没有表现出明显的防治效果,但是可以使花生增产6%左右。2.在杀线虫晶体蛋白基因cry6Aa2操纵子中发现了一个负调控因子。在cry6Aa2基因下游还有一个基因orf2,两基因之间存在一个茎环。处在两基因之间的茎环抑制orf2的表达,使之处于一个相对较低的表达水平。当突变orf2时,cry6Aa2基因表达量明显提高;当在出发菌株YBT-1518中突变orf2基因时,cry6Aa2的表达水平也显著提高;当去掉茎环结构时,orf2得到大量表达,cry6Aa2表达水平急剧降低,这预示着orf2对cry6Aa2基因的表达有负向调控作用。同时EMSA实验还表明orf2表达的蛋白质能结合到茎环上。所有实验结果表明,在克隆的操纵子当中,茎环抑制调节基因orf2的表达,而调节基因orf2表达的蛋白质结合到茎环上,这可能打开茎环,从而影响了cry6Aa2基因转录产物mRNA的稳定性,因而降低了cry6Aa2的表达,从而实现对cry6Aa2表达的负向调控。在苏云金芽胞杆菌中,存在着许多正向调节因子来提高杀虫晶体蛋白基因的表达,而像本研究中orf2这种负向调节因子还比较少见。本研究发现了一个新的晶体蛋白基因表达负向调控模式,为提高晶体蛋白表达量提供了一条新的途径。3.初步研究了晶体蛋白进入根结线虫体内的方式。由于植物寄生线虫大多专性寄生,主要依靠其刺吸式口器—口针从植物细胞内吸取细胞内含物的方式来取食,晶体蛋白很难通过其口针直接进入体内。但是许多研究结果表明,伴胞晶体蛋白的确能够对植物寄生线虫表现出毒力,那么,苏云金芽胞杆菌晶体蛋白是如何进入植物寄生线虫体内并且发生毒力作用的呢?本文以北方根结线虫为作用对象,Westernblot检测发现溶解的晶体蛋白毒素Cry6Aa2的确可以通过某种方式进入根结线虫体内,并且与线虫体内的毒素受体结合,使得毒素分子量明显增加;而用Cry5B毒素感染根结线虫,从线虫体内也能检测到该蛋白,但是发现该蛋白被降解成大约70kDa,这也表明两种典型的杀线虫晶体蛋白Cry6A和Cry5B对线虫的作用方式有差异。用对线虫无毒力的小分子量蛋白Cry51Aa1作用根结线虫时,同样能从其体内检测到该蛋白,但是分子量没有任何变化。用罗丹明标记的Cry6Aa2毒素作用根结线虫,激光共聚焦扫描显微镜观察发现,荧光信号首先出现在线虫体表,随着作用时间的延长,线虫体内才开始出现荧光,而且荧光信号从最初的弥散状态逐渐集中到其肠道组织上。在作用过程中,线虫的口针自始至终都没有荧光出现。该实验结果表明,毒素蛋白可能是通过线虫体壁进入根结线虫体内,然后作用线虫的肠道组织。本实验初步研究了晶体蛋白毒素对植物寄生线虫地作用方式,为利用苏云金芽胞杆菌防治植物寄生线虫提供理论支持。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 植物寄生线虫及其防治
• 1.1 植物寄生线虫概述
• 1.2 植物寄生线虫及其病害的发现
• 1.3 植物寄生线虫的危害
• 1.4 植物寄生线虫的防治
• 1.4.1 植物寄生线虫的化学防治
• 1.4.2 物理和栽培方法
• 1.4.3 生物防治
• 1.4.3.1 天敌利用
• 1.4.3.2 利用微生物和高等植物产生的拮抗性代谢物
• 1.4.3.3 抗性育种
• 2 苏云金芽胞杆菌及其CRY基因的表达调控
• 2.1 苏云金芽胞杆菌及其杀虫活性
• 2.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因
• 2.2.1 杀虫晶体蛋白基因的定位
• 2.2.2 杀虫晶体蛋白基因的分类
• 2.2.3 杀虫晶体蛋白基因的结构特征
• 2.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的表达与调控
• 2.3.1 转录水平的调控
• 2.3.1.1 依赖于芽胞形成的cry基因的转录调控
• 2.3.1.2 不依赖于芽胞形成的cry基因的转录
• 2.3.1.3 启动子及上游区和σ因子与转录调控
• 2.3.1.3.1 启动子与转录调控
• 2.3.1.3.2 启动子上游区与转录调控
• 2.3.1.3.3 σ因子的竞争与转录调控
• 2.4 转录后水平的调控
• 2.4.1 mRNA3′末端的终止子结构
• 2.4.2 mRNA 5′末端的稳定子
• 2.4.3 翻译水平的调控
• 2.5 翻译后水平的调控
• 2.5.1 P20蛋白
• 2.5.2 P19蛋白
• 2.5.3 ORF2和ORF1
• 2.5.4 其它调控蛋白
• 2.6 影响杀虫晶体蛋白基因表达的因素
• 2.6.1 基因拷贝数对表达的影响
• 2.6.2 宿主细胞对cry基因表达的影响
• 2.6.3 cry基因位置对表达的影响
• 2.6.4 cry基因间的协同作用对表达的影响
• 3 苏云金芽胞杆菌对植物寄生线虫的作用
• 3.1 苏云金芽胞杆菌对线虫活性及毒力测定
• 3.1.1 Bt的杀线虫活性
• 3.1.2 Bt对植物寄生线虫毒力的测定
• 3.2 源自Bt的杀线虫基因及其产物
• 3.2.1 Bt中的杀线虫基因及其产物
• 3.2.2 影响Bt对植物寄生线虫毒力的因素
• 3.3 Bt对线虫作用机制
• 3.3.1.苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白的作用机制
• 3.3.2 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对线虫作用机制
• 3.3.2.1 晶体蛋白作用线虫的部位及其病理特征
• 3.3.2.2 线虫体内与抗性相关基因
• 3.3.2.3 线虫体内的毒素蛋白受体
• 3.3.2.4 线虫对毒素蛋白的反应
• 研究目的和意义
• 第二章 苏云金芽胞杆菌YBT-1532菌株对根结线虫的防治效果
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 供试线虫
• 1.1.4 盆栽实验供试材料
• 1.1.5 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌株的培养
• 1.2.2 复红染色
• 1.2.3 用作生物测定的北方根结线虫的培养和繁殖
• 1.2.4 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白的SDS-PAGE
• 1.2.4.1 伴胞晶体蛋白SDS-PAGE样品的制备
• 1.2.4.2 晶体蛋白的SDS-PAGE
• 1.2.5 根结线虫生物测定毒素蛋白样品的制备
• 1.2.6 苏云金素样品的制备及其HPLC定量
• 1.2.7 苏云金芽胞杆菌YBT-1532芽胞粉剂的制备
• 1.2.8 晶体蛋白毒素和苏云金素对北方根结线虫毒力的生物测定
• 1.2.9 苏云金芽胞杆菌YBT-1532对根结线虫防治效果的盆栽实验
• 2 结果与分析
• 2.1 YBT-1532菌株特性
• 2.2 YBT-1532产生的晶体蛋白和苏云金素对北方根结线虫毒力
• 2.3 YBT-1532在盆栽条件下对根结线虫的防治效果
• 3 小结与讨论
• 附录:YBT-1532菌株对根结线虫防治效果的田间试验
• 第三章 苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白基因CRY6AA2表达及其调控
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂和仪器
• 1.1.3.1 试剂
• 1.1.3.2 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 DNA及其RNA操作
• 1.2.1.1 苏云金芽胞杆菌质粒的制备
• 1.2.1.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 1.2.1.3 质粒DNA的纯化
• 1.2.1.4 DNA的体外重组操作
• 1.2.1.5 苏云金芽胞杆菌RNA抽提
• 1.2.2 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定
• 1.2.2.1 大肠杆菌的常规转化
• 1.2.2.2 苏云金芽胞杆菌的电转化
• 1.2.2.3 大肠杆菌转化子的筛选
• 1.2.2.4 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选
• 1.2.3 PCR扩增
• 1.2.4 RT-PCR（Reverse transcript PCR）
• 1.2.5 伴胞晶体蛋白的SDS-PAGE及其定量
• 1.2.6 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体电镜观察
• 1.2.7 在菌株YBT-1518中构建orf2突变体
• 1.2.8 orf2在大肠杆菌中超量表达及其纯化
• 32p]ATP末端标记DNA'>1.2.9 [γ-³²p]ATP末端标记DNA
• 1.2.10 凝胶阻滞（Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA）实验
• 1.2.10.1 EMSA所用试剂及其缓冲液
• 1.2.10.2 10mL 6%非变性凝胶配制
• 1.2.10.3 EMSA实验
• 1.2.11 晶体蛋白毒素对北方根结线虫的毒力测定
• 2 结果与分析
• 2.1 苏云金芽胞杆菌YBT-1518及杀线虫晶体蛋白基因cry6Aa2
• 2.2 含有cry6Aa2基因的HindⅢ克隆片段的结构分析
• 2.3 cry6Aa2表达及其对根结线虫毒力测定
• 2.4 orf2基因表达及茎环结构对其抑制作用
• 2.4.1 orf2基因表达
• 2.4.2 转录水平检测orf2的表达
• 2.5 orf2对cry6Aa2表达的负调控作用
• 2.6 orf2对cry6Aa2表达的负向调节作用方式
• 2.6.1 ORF2蛋白超量表达及其纯化
• 2.6.2 ORF2蛋白质结合茎环结构
• 3 小结与讨论
• 第四章 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫作用机制研究
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 线虫
• 1.1.3 抗体制备动物
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 试剂与仪器
• 1.1.5.1 试剂
• 1.1.5.2 溶液及缓冲液
• 1.1.5.2.1 线虫培养、毒素蛋白制备及Western blot缓冲液
• 1.1.5.2.2 双向电泳缓冲液
• 1.1.5.3 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 北方根结线虫的饲养与分离
• 1.2.2 秀丽小杆线虫培养
• 1.2.3 苏云金芽胞杆菌培养与晶体蛋白毒素的制备
• 1.2.4 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白抗血清的制备
• 1.2.5 异硫氰酸荧光素（FITC）标记晶体蛋白毒素
• 1.2.6 罗丹明标记晶体蛋白及其纯化
• 1.2.7 晶体蛋白作用根结线虫
• 1.2.8 晶体蛋白作用秀丽小杆线虫
• 1.2.9 Western blot
• 1.2.10 荧光显微镜观察
• 1.2.11 激光共聚焦扫描显微镜观察
• 1.2.12 双向电泳
• 1.2.12.1 用作双向电泳的线虫样品制备
• 1.2.12.2 双向电泳
• 2 结果与分析
• 2.1 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白毒素的制备与纯化
• 2.1.1 Cry6Aa2晶体蛋白的制备
• 2.1.2 Cry5Ba2晶体蛋白的制备
• 2.1.3 Cry51Aa1晶体蛋白的制备
• 2.2 Western blot检测晶体蛋白毒素进入根结线虫体内
• 2.2.1 Western blot检测进入线虫体内的Cry6Aa2毒素
• 2.2.2 Western blot检测进入根结线虫体内的Cry5B毒素
• 2.2.3 Western blot检测进入根结线虫体内的Cry51Aa1毒素
• 2.3 FITC标记的晶体蛋白Cry6Aa2作用根结线虫
• 2.4 罗丹明标记晶体蛋白Cry6Aa2效果
• 2.5 荧光标记蛋白毒素作用线虫
• 2.5.1 荧光标记蛋白毒素作用秀丽小杆线虫
• 2.5.2 荧光标记蛋白毒素作用根结线虫
• 2.6 双向电泳分离鉴定线虫体内的毒素蛋白受体
• 3 小结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文附录