小麦与白粉菌互作中与亲和性相关的基因研究

论文摘要

由专性寄生菌Blumeria graminis f.sp.tritici引起的小麦白粉病是小麦最严重的病害之一。为了研究植物与活体寄生菌亲和性反应机理，我们以小麦-白粉菌为体系，研究了小麦对白粉菌的亲和性因子。小麦品种扬158接种白粉菌菌株Qiul后，表现过敏性坏死反应（HR），接种菌株Bai3后表现亲和性感病反应（S）。本研究以扬158接种菌株Bai3和Qiul 5d的小麦叶片及未接种叶片为对照，采用cDNA-AFLP方法分离筛选与小麦感病性相关基因，在接种Bai3 5d后的感病叶片共筛选得到223个差异性表达片段，其中有75％可重新扩增，对85个片段进行了测序分析，有41个片段与已知序列具有同源性。在这41个片段中，有26个片段的同源性较高（E＞1e-03）。对编码叶绿体假设蛋白、开花协调子蛋白、乙烯蛋白激酶抑制子、Clone wlm96.pk028.k4：fis，full insert mRNA、ROP6蛋白、糖基转移酶家族蛋白1、肌醇六磷酸酶、叶绿体核糖体蛋白、延伸因子1gamma-like蛋白、Triticum aestivum，mRNA、Gigantea 3和Patatin-like蛋白等12个感兴趣基因进行了RT-PCR分析。结果表明，编码开花协调子蛋白和肌醇六磷酸酶的基因与小麦对白粉菌的亲和性的关系不大，而其它10个基因片段均为差异性表达。编码乙烯蛋白激酶抑制子和Clone wlm96.pk028.k4：fis，full insert mRNA的基因仅在抗病和感病叶片中表达，并在感病叶片接种5d时表达最显著。编码ROP6蛋白、延伸因子1 gamma-like蛋白、Triticum aestivum，mRNA、Gigantea 3和patatin-like蛋白的基因仅在感病叶片中表达，其中编码ROP6蛋白、延伸因子1gamma-like蛋白和Patatin-like蛋白的基因在感病叶片接种1d，2d，5d和7d时均表达，且表达量在第5d达到峰值。编码Gigantea 3的基因在感病叶片接种5d和7d时表达，且在第5d表达要显著一些。编码mRNA的基因仅在感病叶片接种5d时表达。这5个仅在感病叶片中表达的基因可能与小麦对白粉菌的亲和性相关。对编码乙烯蛋白激酶抑制子、Clone wlm96.pk028.k4：fis，full insert mRNA、编码ROP6蛋白、Triticum aestivum，mRNA、Gigantea 3和Patatin-like蛋白等6个感兴趣基因进行了Northern杂交验证，结果与RT-PCR基本一致。本研究初步筛选了小麦对白粉菌感病相关基因，它们参与了营养需求供给、防卫抑制以及抑制细胞的程序性死亡等过程。该研究为进一步了解活体寄生菌抑制植物防卫反应和利用植物活体营养的分子机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 植物对白粉菌的亲和性研究进展
• 1.1 植物与白粉菌的接触识别
• 1.2 白粉菌的毒性因子
• 1.3 白粉菌对寄主防卫反应的抑制
• 1.4 抑制细胞死亡
• 1.5 植物对白粉菌的亲和性因子
• 2 小麦对白粉菌亲和性研究进展
• 3 本研究的目的与意义
• 第二章 小麦对白粉菌感病性相关基因的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料与菌株
• 1.1.2 PCR引物及接头
• 1.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂
• 1.1.4 其它试剂、培养基
• 1.1.5 酶、试剂盒及其他试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 接种方法
• 1.2.2 筛选感病差异性表达基因
• 1.2.2.1 总RNA提取
• 1.2.2.2 cDNA合成
• 1.2.2.3 酶切-连接反应
• 1.2.2.4 预扩反应
• 1.2.2.5 选择性扩增反应
• 1.2.2.6 差异表达基因的筛选
• 1.2.3 差异性cDNA片断的克隆与测序
• 1.2.3.1 差异性cDNA片断的回收纯化与载体连接
• 1.2.3.2 利用大肠杆菌感受态细胞进行质粒转化
• 1.2.3.3 序列测定
• 1.2.4 序列的同源性比较
• 2 结果与分析
• 2.1 接种结果
• 2.2 总RNA提取
• 2.3 单链cDNA和双链cDNA的合成
• 2.4 预扩产物
• 2.5 差异表达片断的筛选结果
• 2.6 差异性cDNA片段的克隆与测序结果
• 2.7 序列的同源性比较结果
• 2 讨论
• 第三章 部分基因在抗感小麦叶片中的表达动态分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料与菌株
• 1.1.2 PCR引物
• 1.1.3 RNA变性、电泳和杂交用溶液及试剂
• 1.1.4 酶、试剂盒及其它试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 接种方法
• 1.2.2 总RNA的提取
• 1.2.3 部分cDNA克隆的RT-PCR验证
• 1.2.3.1 cDNA第一链的合成
• 1.2.3.2 引物设计
• 1.2.3.3 RT-PCR扩增
• 1.2.4 部分cDNA克隆的Northern杂交
• 1.2.4.1 Northern杂交膜的制备
• 1.2.4.2 预杂交
• 1.2.4.3 探针制备及杂交
• 1.2.4.4 洗膜
• 1.2.4.5 压片及成象
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA的提取
• 2.2 部分cDNA克隆的RT-PCR验证结果
• 2.3 部分cDNA克隆的Northern杂交验证结果
• 3 讨论
• 研究展望
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 参考文献
• 致谢