论文摘要
阿片类毒品滥用是严重影响我国经济繁荣、人口素质提高和社会安定的重要问题,因而,深入认识阿片依赖的神经生物学机制,研发有效的防复吸药物不仅具有重要的科学意义,也具有重大的社会、经济效益。胍丁胺是本实验室在研的一种作用于非阿片系统的新型防复吸药物。本实验室前期对胍丁胺药效学进行了全面的研究,发现具有显著的预防和治疗吗啡所致的耐受、躯体依赖及精神依赖的作用,并提出胍丁胺作用机制可能与激活I1-咪唑啉受体（I1-imidazoline Receptor,I1R）有关的假说。但是,由于胍丁胺本身能够作用于多种靶分子,而这些分子都与阿片依赖密切相关;再者I1R没有特异性拮抗剂,难以用经典药理学方法确定其作用,因而到目前为止I1R是否为胍丁胺抗阿片依赖的作用靶标尚未最终明确。由于克隆的I1R候选蛋白IRAS（imidazoline receptor antisera selected protein,IRAS）经证实为天然的功能性I1R,因而本研究采用RNA干扰技术,特异性下调IRAS的表达,在细胞水平以及整体水平证明I1R是否为胍丁胺抗阿片依赖的作用靶点。在细胞水平,首先应用稳定共转染大鼠μ阿片受体和人源IRAS的细胞系（CHO-μ/IRAS细胞）研究胍丁胺抗阿片依赖作用与I1R的关系。应用LipofectamineTM2000脂质体转染的方法将设计合成的siRNA转染至CHO-μ/IRAS细胞,筛选出有效片断。对该有效siRNA进行干扰效果的量效和时效关系的研究表明,该siRNA浓度降低到40 nM时仍能有效下调IRAS的表达,siRNA转染后24 h在mRNA水平下调效果最明显,而在蛋白水平以转染后48 h最明显,其干扰效果可以持续约2天。在确定设计合成的siRNA能够有效下调IRAS在CHO-μ/IRAS细胞中表达的基础上,我们以3’,5’-环磷酸腺苷（adenosine 3’,5’-cyclic phosphate,cAMP ）超射这一公认的在细胞生物学水平上反映阿片类物质依赖及戒断的生化指标,研究胍丁胺对吗啡依赖形成的影响以及与I1R的关系。应用竞争免疫荧光法（LANCETM cAMP384试剂盒）对cAMP进行测定,发现当吗啡（100μM）处理CHO-μ/IRAS细胞24 h后,纳洛酮（100μM）催促15 min,胞内cAMP水平升高到空白对照的三倍以上,表明细胞依赖模型建立成功。胍丁胺单药作用CHO-μ/IRAS细胞24 h不影响cAMP的含量,而当胍丁胺（0.01-10μM）与吗啡（100μM）共同处理细胞24 h,再用纳洛酮（100μM）催促15 min,cAMP超射水平呈胍丁胺浓度依赖性的降低,其IC50为0.36μM。应用RNA干扰技术下调IRAS表达后（即转染siRNA后48 h）,建立CHO-μ/IRAS细胞的吗啡依赖模型及胍丁胺干预模型。结果表明,IRAS的下调对纳洛酮催促引起吗啡依赖细胞的cAMP超射水平没有影响。而与空白对照和阴性对照相比,胍丁胺（100 nM、1μM）对吗啡慢性作用纳洛酮催促引起的cAMP超射的抑制程度明显降低,表明在CHO-μ/IRAS细胞胍丁胺抗阿片依赖作用是由IRAS介导的。由于CHO-μ/IRAS细胞是转染的细胞系,与内源性表达I1R和阿片受体的神经元可能存在差异。因而,我们进一步在原代培养的海马神经元中,研究I1R与胍丁胺抗吗啡依赖的关系。应用TransMessengerTM转染试剂,将针对大鼠源I1R的siRNA转染至海马神经元细胞,筛选出有效的siRNA。对该siRNA干扰海马神经元I1R的时效关系研究发现,在mRNA水平以siRNA转染后24 h干扰效果最为明显,在蛋白水平以转染后72 h干扰效果最为明显,其干扰效果可以持续至少3 d。siRNA在海马神经元中与在CHO-μ/IRAS细胞中的作用时效存在差异,原因可能与siRNA复合体在海马神经元中更加稳定,以及海马神经元无细胞分裂、增殖过程有关。在研究胍丁胺对海马神经元吗啡依赖的作用之前,我们首先对海马神经元吗啡依赖模型的建立条件进行了摸索,发现吗啡（10μM）慢性作用海马神经元24 h,纳洛酮（10μM）催促不能引起cAMP超射;而当吗啡作用时间延长至48 h,纳洛酮催促能够使cAMP水平升高到约2.7倍,表明海马神经元吗啡依赖模型建立成功。胍丁胺（10 nM-10μM）作用于海马神经元48 h,对海马神经元的cAMP含量没有影响。而胍丁胺（0.01-10μM）与吗啡共同处理海马神经元,使吗啡慢性作用纳洛酮催促引起的cAMP超射呈胍丁胺浓度依赖性的降低,其IC50为3.4μM。以上结果表明,在原代培养的海马神经元中胍丁胺具有抑制吗啡依赖的作用。为了在海马神经元中研究I1R与胍丁胺抗吗啡依赖的关系,我们首先采用咪唑啉受体/α2-肾上腺素受体（α2-adrenergic receptor,α2-AR）混合拮抗剂依法克生以及α2-AR拮抗剂育亨宾进行研究。结果表明,依法克生和育亨宾本身对海马神经元的cAMP基础水平没有影响,也不影响纳洛酮催促引起的吗啡依赖海马神经元的cAMP超射。依法克生能拮抗胍丁胺对cAMP超射的抑制作用,而育亨宾则不能,从而提示胍丁胺在海马神经元的抗阿片依赖作用至少部分与激活咪唑啉受体有关而不是α2-AR。为进一步确定I1R与胍丁胺抗阿片依赖的关系,我们应用RNA干扰技术下调海马神经元的I1R表达。结果表明,胍丁胺（100 nM、1μM）对吗啡慢性作用纳洛酮催促引起的cAMP超射的抑制作用明显减弱,低浓度胍丁胺作用的下调程度尤为明显,接近吗啡组的水平。由此表明,在原代培养的海马神经元中胍丁胺对吗啡依赖的抑制作用是由I1R介导的。在整体动物水平,我们应用专用于鼠脑转染的两种脂质体（DOPE + jetSITM）混合使用以介导siRNA进入小鼠侧脑室及周围脑区,并应用脑立体定位、侧脑室埋管技术,以达到长期注射siRNA的目的。应用此方法,发现在连续注射siRNA后的第5天在mRNA水平I1R具有显著下调,第7天在蛋白水平I1R具有显著下调,随着干扰时间及注射siRNA次数的增加,干扰效果愈加明显。在整体动物水平对胍丁胺抗阿片依赖作用与I1R关系的研究中,我们采用躯体依赖戒断症状这一行为学指标以及FosB及ΔFosB变化这一生化学指标进行评价。应用siRNA干扰7 d后的小鼠,即I1R在蛋白水平显著下调时,开始建立吗啡依赖（30 mg/kg,s.c.一日三次,共四天）模型及胍丁胺干预模型（胍丁胺5 mg/kg,s.c.与吗啡伴随给药）。在空白对照组、阴性对照组以及干扰组,小鼠经吗啡连续给药后,在纳洛酮催促下出现典型的戒断综合征,表现为纵向跳跃、扭体、眼睑下垂、咀嚼、腹泻及体重减轻。胍丁胺伴随吗啡给药后,在空白对照组和阴性对照组,所有戒断综合征均明显减轻,表明胍丁胺具有抗阿片依赖作用,与本课题组以前的研究结果一致。而在干扰组,胍丁胺对于吗啡依赖后戒断综合征的抑制程度明显降低,干扰后的胍丁胺伴随吗啡组与吗啡给药组相比无明显差异。在小鼠戒断后最明显的跳跃症状方面,相对于吗啡依赖小鼠的跳跃次数,胍丁胺伴随吗啡给药后,对跳跃次数的抑制百分率在空白对照组为63.1±3.2%,阴性对照组为58.9±3.9%,干扰组下降到30.6±6.7%,表明I1R干扰后明显下调了胍丁胺对阿片依赖的抑制作用。小鼠戒断症状观察完毕后,应用Western blot方法检测FosB和ΔFosB在纹状体和伏隔核的表达。结果表明,吗啡依赖后FosB和ΔFosB在纳洛酮催促戒断小鼠的纹状体和伏隔核中均有不同程度的升高,ΔFosB的升高程度大于FosB。应用胍丁胺干预后,与吗啡依赖小鼠相比,空白对照及阴性对照的FosB和ΔFosB均明显下降。而I1R干扰的小鼠应用胍丁胺后,与吗啡依赖的小鼠相比,FosB和ΔFosB无显著降低,表明I1R的下调降低了胍丁胺抗阿片依赖的作用。由于ΔFosB是与精神依赖相关的转录因子,因而提示胍丁胺具有抗阿片精神依赖作用,其作用与I1R有关。本研究通过下调I1R的表达,在细胞水平和整体水平了研究胍丁胺对阿片依赖的调节及其与I1R的关系,得到以下结论:1、应用CHO-μ/IRAS细胞证明,胍丁胺抑制吗啡慢性作用纳洛酮催促引起的cAMP通路超敏的形成,其作用是由I1R介导的;2、在原代培养的海马神经元中证明,胍丁胺抑制吗啡慢性作用纳洛酮催促引起的cAMP通路超敏的形成,其作用是由I1R介导的。3、应用小鼠吗啡依赖的戒断模型证明,胍丁胺显著抑制吗啡长期处理纳洛酮催促引起的小鼠戒断症状以及伏隔核和纹状体内FosB和ΔFosB表达的增加,胍丁胺此作用由I1R介导。通过本研究,我们首次阐明了I1R是胍丁胺抗阿片依赖的主要作用靶点,为本课题组提出的“胍丁胺-咪唑啉受体构成了又一新的阿片功能调节系统”的创新性学术观点提供了重要依据。
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