论文摘要
目的:严重感染脓毒血症仍然是导致急性肺损伤最重要和常见的原因,目前尚缺乏十分有效的治疗手段。本研究旨在观察骨髓间充质干细胞（MSC）在脂多糖（LPS）诱发的大鼠急性肺损伤肺组织中的植入和分布,以及MSC对LPS致大鼠急性肺损伤的生物学作用和可能的机制,为干细胞治疗急性肺损伤提供实验线索。方法和结果:1.大鼠骨髓MSC的分离培养和鉴定采用密度梯度离心和全骨髓贴壁分离法均能成功分离纯化雄性大鼠骨髓MSC,P4代细胞呈均一的长条形、梭形等成纤维细胞样特征性形态,流式细胞仪检测细胞表面标志呈CD34-/CD45-/CD90+,并具有成骨、成脂肪分化潜能。2.雄性MSC在雌性大鼠肺组织中的植入制备雄性大鼠性别决定基因（Sry）探针,应用荧光原位杂交（FISH）技术观察静脉注入雄性MSC后,雄性MSC在雌性大鼠肺组织中的植入。结果显示给予LPS和生理盐水（NS）组没有检测到呈sry基因阳性的细胞,给予NS和MSC组仅在6h和1d发现阳性细胞,给予LPS和MSC组直到3w仍有阳性细胞,阳性细胞存在于肺泡腔内侧和间质,分布不均,损伤较重的部位更明显,但阳性细胞总体比例不高（＜10%）。3.MSC对静脉注射LPS致大鼠急性肺损伤生物学作用的体内研究65只雌性SPF级Wistar大鼠随机分为①正常对照组（n=15）经尾静脉注射等量NS,2h后经另一侧尾静脉注射雄性MSC,1×106/只;②肺损伤组（n=25）,经尾静脉注射LPS 8mg/kg,2h后经另一侧尾静脉注射等量NS;③MSC干预组（n=25）,经尾静脉注射LPS 8mg/kg,2h后经另一侧尾静脉注射雄性MSC,1×106/只。每组在注射MSC后6h、24h、4d、1w和3w处死动物。结果显示肺损伤组6h PaO267.1±11.6mmHg,较对照组显著降低,肺组织病理表现为不同程度的充血和出血、肺泡破坏、间隔增宽、大量中性粒细胞聚集等表现,肺湿干比、BALF中总蛋白含量及肺组织MPO活性迅速升高,与正常对照组比较有显著差异（P＜0.01）;与肺损伤组比较,MSC干预组4d时对降低BALF中中性粒细胞数量、肺组织MPO活性和炎症细胞浸润程度评分有统计学意义（P＜0.05）,显著降低了血清促炎因子TNF-α和IL-1β浓度（P＜0.05）,对血清抗炎因子IL-10的作用不显著,有提高动物生存率和降低3w点肺组织羟脯氨酸（HYP）含量的趋势,但尚未达到统计学意义（P=0.22和P=0.09）。4.MSC对腹腔注射LPS致大鼠急性炎症性肺损伤治疗作用的体内研究60只雌性SPF级Wistar大鼠随机分为①空白对照组（n=20）经腹腔注射等量NS;②肺损伤组（n=20）,经腹腔注射LPS 2mg/kg,1h后经尾静脉注射等量NS;③MSC干预组（n=20）,经腹腔注射LPS 2mg/kg,1h后经尾静脉注射雄性MSC,1×106/只。每组在注射MSC后6h、24h、48h和2w处死动物。肺损伤组肺组织病理表现为血管充血和以中性粒细胞浸润为主的细胞数量增多,6h时即出现,24h时最明显,48h时炎症较前减退,2w时肺组织基本恢复正常。MSC干预组6h时肺组织病理较肺损伤组轻,24h时继续减轻,48h时肺组织基本恢复正常。与肺损伤组相比,MSC干预组显著降低了肺湿干比、BALF中总蛋白含量及肺组织中中性粒细胞数量（P＜0.05）,而且显著降低了血清促炎因子TNF-α、IL-1β和MIP-1α浓度（P＜0.01）,但对抗炎因子IL-10的升高作用尚未达到统计学意义（P=0.21）。5.MSC与LPS损伤的肺部细胞相互作用的体外研究首先分离培养大鼠肺泡巨噬细胞（AM）、肺微血管内皮细胞（EC）和肺细胞（LC）。（1）MSC与LPS损伤AM的相互作用采用膜孔径0.4um的Transwell小室,分为①MSC单独培养组②AM单独培养组③MSC和AM直接共培养组④MSC和AM间接共培养组,分别以LPS损伤4h后,MSC和AM直接共培养组和间接共培养组均较AM单独培养组显著降低了培养液上清促炎因子TNF-α、IL-1β和MIP-1α浓度（P＜0.05或0.01）,直接共培养组作用更显著,对MIP-1α的降低作用与间接共培养组比较P＜0.05,并且升高了抗炎因子IL-10浓度,与AM单独培养组比较P＜0.05。（2）MSC与LPS损伤肺部细胞的相互作用——MSC的体外迁移采用膜孔径3um的Transwell小室,上室接种MSC,下室分别接种AM、AM+EC和LC,分为实验组和空白对照组,实验组给予LPS损伤,共培养3d后,实验组MSC迁移细胞数均较空白对照组明显增多（P＜0.01）,迁移细胞的形态无变化,AM+EC组迁移细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色呈阴性。结论1骨髓MSC可成功分离纯化,并在体外稳定培养。2骨髓MSC不仅在体内能向损伤肺组织归巢,抑制LPS诱导的局部和全身炎症反应,进而发挥对急性炎症性肺损伤的治疗作用,而且,在体外也能向受损肺部细胞迁移,影响局部细胞因子的产生,并且这种作用除了直接接触的机制外,还可能通过体液调节的方式,调节促炎和抗炎的微环境,有利于急性肺损伤的修复。
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