产γ-内酰胺水解酶菌株的诱变及高产菌株的筛选

论文摘要

(2S,3R)-2-氮杂双环[2,2,1]庚-5-烯-3-酮[以下简称（-）γ-内酰胺]是合成阿巴卡韦（abacavir）的原料,具有重要的应用价值。微生物酶法拆分（+/-）γ-内酰胺生产（-）γ-内酰胺具有良好的应用前景。对已筛选出的能立体选择性水解（+/-）γ-内酰胺得到（-）γ-内酰胺的菌株L29-9进行紫外线诱变,再以紫外线诱变筛选出的高产菌株为出发菌株,进行化学诱变（硫酸二乙酯）,使原始菌株发生基因突变,从大量突变株中筛选出一株高产、稳定的突变株L29-9-B-4,其酶活由原菌株的45U/g增加到539U/g。对L29-9-B-4产酶培养基及转化条件进行了研究。结果表明：当选择可溶性淀粉6g/L、牛肉浸膏5g/L、N-乙酰苯丙氨酸4g/L、pH7.0、温度30℃、培养时间40h时,通过完整细胞转化pH8.0的γ-内酰胺溶液,在30℃下经过2h的反应,产物（-）γ-内酰胺ee值99.8%。对L29-9-B-4的细胞固定化进行初步研究,采用几种固定化材料进行研究。结果表明采用聚乙烯醇、海藻酸钙联合包埋法进行细胞固定化的效果最佳。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 手性化合物
• 1.1.1 手性药物及手性中间体的合成
• 1.1.1.1 化学拆分法
• 1.1.1.2 不对称合成
• 1.1.1.3 微生物或酶催化拆分
• 1.1.2 微生物转化反应的特点
• 1.2 （-）2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮（简称γ-内酰胺）及其应用
• 1.3 （+/-）)γ-内酰胺的拆分研究进展
• 1.3.1 色谱分离法
• 1.3.2 微生物酶法
• 1.4 诱变育种
• 1.4.1 诱变机理
• 1.4.2 诱变剂的选择
• 1.4.3 诱变育种的应用及研究进展
• 1.5 产γ-内酰胺酶高产菌株发酵条件的优化
• 1.5.1 培养基的组成
• 1.5.2 培养条件
• 1.6 细胞固定化
• 1.6.1 细胞固定化材料
• 1.6.1.1 天然高分子凝胶载体
• 1.6.1.2 合成有机高分子凝胶载体
• 1.6.1.3 无机载体
• 1.6.1.4 复合载体
• 1.6.2 细胞固定化材料的选择依据
• 1.6.3 细胞固定化方法
• 1.6.3.1 包埋法
• 1.6.3.2 吸附法
• 1.6.3.3 共价结合法
• 1.6.3.4 交联法
• 1.6.3.5 絮凝法
• 1.6.4 细胞固定化方法的选择
• 1.6.5 细胞固定化研究进展
• 1.6.6 细胞固定化的应用
• 1.6.6.1 废水处理中的应用
• 1.6.6.2 酿酒工业中的应用
• 1.6.6.3 生物传感器
• 1.6.6.4 其它领域
• 1.7 课题研究的意义及内容
• 第二章 γ-内酰胺水解酶高产菌株的选育
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要试剂、药品
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 菌种
• 2.2.5 出发菌株的活化
• 2.2.6 培养与转化方法
• 2.2.6.1 斜面培养方法
• 2.2.6.2 种子液培养方法
• 2.2.6.3 摇瓶培养方法
• 2.2.6.4 生物量的测定
• 2.2.6.5 菌株的试管培养及预处理
• 2.2.6.6 菌株的摇瓶培养及预处理
• 2.2.6.7 完整细胞转化γ-内酰胺
• 2.2.6.8 转化产物ee值的测定及计算方法
• 2.2.6.9 酶活定义及酶活测定方法
• 2.2.7 稀释度实验以及菌悬液的制备
• 2.2.8 紫外线诱变方法
• 2.2.8.1 紫外线照射剂量的选择
• 2.2.8.2 紫外线诱变具体方法
• 2.2.9 化学诱变方法
• 2.2.9.1 硫酸二乙酯（DES）剂量的选择
• 2.2.9.2 化学诱变具体方法
• 2.2.10 突变株筛选方法
• 2.2.10.1 初筛方法
• 2.2.10.2 复筛方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 出发菌株酶活及ee值检测结果
• 2.3.2 生物量测定结果
• 2.3.3 内标法标准曲线
• 2.3.4 稀释度试验结果
• 2.3.5 紫外线诱变
• 2.3.5.1 致死率与紫外线照射时间关系
• 2.3.5.2 初筛
• 2.3.5.3 复筛
• 2.3.6 化学诱变
• 2.3.6.1 DES剂量的选择
• 2.3.6.2 致死率与DES处理时间关系
• 2.3.6.3 初筛
• 2.3.6.4 复筛
• 2.3.6.5 突变菌遗传稳定性考察
• 2.4 小结
• 第三章 高产菌株发酵条件优化及转化条件研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要试剂、药品
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 菌种和培养基
• 3.2.3.1 菌种
• 3.2.3.2 种子液培养基
• 3.2.3.3 摇瓶培养基
• 3.2.3.4 研究培养条件时的培养基
• 3.2.4 实验方法
• 3.2.4.1 菌株L29-9-B-4的液体培养及预处理
• 3.2.4.2 菌株L29-9-B-4完整细胞转化γ-内酰胺
• 3.2.4.3 HPLC确定酶活及ee值
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 碳源对酶活的影响
• 3.3.2 氮源对酶活的影响
• 3.3.3 可溶性淀粉浓度对酶活和转化产物ee值的影响
• 3.3.4 牛肉膏浓度对酶活和ee值的影响
• 3.3.5 诱导物浓度对酶活和ee值的影响
• 3.3.6 生长曲
• 3.3.7 培养时间对转化产物ee值的影响
• 3.4 转化过程中参数的影响
• 3.4.1 底物γ-内酰胺浓度对转化产物ee值及产率的影响
• 3.4.2 pH值对转化的影响
• 3.4.3 反应体系中温度对转化的影响
• 3.4.4 反应体系中转化时间对转化的影响
• 3.4.5 反应体系中添加表面活性剂的影响
• 3.5 小结
• 第四章 高产菌株的固定化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要试剂、药品
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 菌种和培养基
• 4.2.3.1 菌种
• 4.2.3.2 种子液培养基
• 4.2.3.3 摇瓶培养基
• 4.2.4 菌株L29-9-B-4的液体培养
• 4.2.4.1 种子培养
• 4.2.4.2 摇瓶培养
• 4.2.5 菌悬液的制备
• 4.2.6 固定化方法
• 4.2.6.1 海藻酸钙包埋法
• 4.2.6.2 聚乙烯醇交联法
• 4.2.6.3 聚乙烯醇-海藻酸钙联合包埋法
• 4.2.6.4 明胶-戊二醛交联法
• 4.2.6.5 海藻酸铝包埋法
• 4.2.6.6 海藻酸钙-壳聚糖联合包埋法
• 4.2.7 固定化细胞ee值的测定
• 4.2.8 聚乙烯醇-海藻酸钙凝胶混合固定化条件优化
• 4.2.9 菌体加入量对固定化细胞成型效果及产物ee值的影响
• 4.2.10 固定化细胞转化批次的研究
• 4.2.11 有机溶剂处理对固定化细胞转化的影响
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 几种固定化方法的比较
• 4.3.2 聚乙烯醇-海藻酸钙凝胶混合固定化条件优化
• 4.3.3 菌体加入量对固定化细胞成型效果及产物ee值的影响
• 4.3.4 固定化细胞转化批次
• 4.3.5 有机溶剂处理对固定化细胞转化的影响
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者及导师简介
• 附件