论文题目: 猪繁殖与呼吸综合征双基因及佐剂活病毒载体疫苗与DNA疫苗研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖学
作者: 赵武
导师: 陈焕春,熊远著
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒,修饰型基因,基因,共表达,牛疱疹病毒型,免疫佐剂,重组伪狂犬病毒,疫苗
文献来源: 华中农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来，现已遍及世界各主要养猪国家与地区，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。同其它多数病毒病的防制一样，免疫接种仍是预防与控制PRRS的主要措施。目前用于预防PRRS的主要商用疫苗是传统常规疫苗弱毒疫苗和灭活疫苗。但已证实弱毒苗存在散毒及高几率毒力返强的安全隐患，国外许多国家已禁用弱毒苗。灭活苗尽管安全性较好，但不仅需多次重复接种，而且免疫效果不理想，还经常可导致免疫失败。因此，迫切需要更安全、高效、廉价的新型疫苗来预防和控制PRRS的发生与流行。 蛋白转导是新近发展和建立起来的一种富有生命力的新技术。其高效的跨膜转运功能和在细胞间自主传递的特点，为提高新型疫苗免疫效应提供了新的思路和有效手段。目前已证实具有独特蛋白转导特性的来源于a-疱疹病毒亚科的VP22同源物，能显著提高与之融合的外源蛋白的递呈效率进而提高其免疫原性，并证实可显著提高DNA疫苗或腺病毒载体疫苗的免疫效应，其中牛疱疹病毒1型(BHV-1)VP22是极具开发应用潜力的新型高效的蛋白转导免疫增强佐剂分子。 鉴于此，本研究以PRRSV两个最主要的保护性抗原基因—经修饰具有更好免疫原性的ORF5基因(ORF5M)以及ORF6基因为靶基因，以BHV-1 VP22为免疫增强佐剂分子，开展了以伪狂犬病毒(PRV)为载体的PRRS双基因及佐剂活病毒载体疫苗以及PRRS双基因及佐剂DNA疫苗研究，主要研究内容如下： 1、双基因及佐剂重组伪狂犬病毒TK~-／gE~-／VP22E~+／VP22M~+的构建与免疫反应采用PCR方法从含BHV-1 VP22基因及PRRSV ORF5M基因的质粒中，扩增到不含终止子的VP22基因以及ORF5M基因的完整编码区，并进行了克隆和序列分析，经序列测定证实两基因均未发生碱基突变。将ORF5M及VP22基因依次插入到PRV通用转移载体pIECMV中，构建了含VP22-ORF5M融合基因的PRV转移质粒pIECMV-VP22ORF5M。再将与VP22基因融合的PRRSV ORF6基因表达盒插入到pIECMV-VP22ORF5M中，构建了含VP22-ORF5M与VP22-ORF6融合基因的PRV转移质粒pIECMV-VP22ORF5M-VP22ORF6。采用脂质体介导法将转移质粒与EcoRI线性化后的PRV gE基因缺失标记疫苗株TK~-／gE~-／LacZ~+基因组共转染IBRS-2细胞，出现细胞病变(CPE)的转染产物经蚀斑纯化结合PCR扩增筛选，构建了融合表达VP22与ORF5M基因的单基因及佐剂重组伪狂犬病毒(rPRV)TK~-／gE~-／VP22E~+，以及共表达与VP22融合的ORF5M与ORF6基因的双基因及佐剂rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+／VP22M~+，并经PCR、Southern blot、Western blot、IFA证实构建正确，外源融合基因得到表达，并具有免疫学活性。而且外源基因的插入不影响rPRV在IBRS-2或PK-15细胞上的增殖。
论文目录:
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
第1章 文献综述
1.1 猪繁殖与呼吸综合征
1.2 PRRS的危害及流行病学特点
1.3 PRRSV病原特性
1.3.1 PRRSV的分类
1.3.2 PRRSV的理化学特性
1.3.3 PRRSV的抗原性
1.3.4 PRRSV的细胞增殖特性
1.3.5 PRRSV的致病机理及生物学特性
1.4 PRRSV分子生物学研究进展
1.4.1 PRRSV基因组的结构与功能
1.4.2 PRRSV的蛋白质
1.4.3 PRRSV的基因组变异和RNA重组
1.4.4 PRRSV的抗原性变异
1.4.5 PRRSV的毒力变异
1.4.6 PRRSV的准种
1.4.7 PRRSV的单克隆抗体
1.5 PRRSV的免疫学反应
1.5.1 抗PRRSV的体液免疫反应
1.5.2 抗PRRSV的细胞免疫反应
1.5.3 PRRSV与免疫抑制
1.6 PRRS疫苗研究进展
1.6.1 PRRS传统常规疫苗
1.6.2 PRRS新型疫苗研究进展
1.7 免疫佐剂简介
1.7.1 免疫佐剂应用的优点
1.7.2 免疫佐剂的分类及其作用机理
1.8 蛋白转导
1.8.1 蛋白转导的发现
1.8.2 PTD结构组成特点
1.8.3 VP22 PTD作用特点
1.8.4 VP22 PTD作用机理
1.8.5 VP22蛋白转导的应用前景
第2章 研究的目的与意义
第3章 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 毒株、细胞与菌株
3.1.2 载体与质粒
3.1.3 工具酶及主要试剂
3.1.4 本研究中所用的PCR引物
3.1.5 培养基与抗生素及其配制
3.1.6 免疫反应试验所用抗原及血清
3.1.7 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.8 实验动物
3.1.9 主要实验仪器及设备
3.2 试验方法
3.2.1 目的外源基因的PCR扩增
3.2.2 限制性内切酶酶切反应
3.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.4 线性质粒DNA末端去磷酸化
3.2.5 质粒DNA片段的3′凹端补平
3.2.6 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.7 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.9 连接产物的转化
3.2.10 质粒的制备与鉴定
3.2.11 伪狂犬病毒(PRV)基因组DNA的提取
3.2.12 脂质体共转染法
3.2.13 重组病毒的蚀斑纯化
3.2.14 PCR检测目的外源基因在重组病毒中的整合
3.2.15 Southern blot印迹分析
3.2.16 质粒转染(脂质体介导转染法)
3.2.17 间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白的体外表达
3.2.18 Western blot检测目的蛋白的体外表达
3.2.19 间接ELISA试验
3.2.20 半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定
3.2.21 微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)
3.2.22 细胞免疫的检测
3.2.23 动物试验
3.2.24 统计学方法
第4章 结果与分析
4.1 PRRS单／双基因及佐剂rPRV的构建及实验免疫研究
4.1.1 PRRS单／双基因及佐剂rPRV的构建流程
4.1.2 单基因及佐剂rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+的构建
4.1.2.1 含VP22-ORF5M融合基因转移质粒的构建与鉴定
4.1.2.2 rPRV TK~-/gE~-／VP22E~+的筛选与纯化
4.1.2.3 rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+的PCR鉴定
4.1.2.4 rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+的Southern blot鉴定
4.1.2.5 rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+的IFA试验
4.1.2.6 rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+的Western blot鉴定
4.1.3 双基因及佐剂rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+／VP22M~+的构建
4.1.3.1 含VP22-ORF5M及VP22-ORF6融合基因转移质粒的构建与鉴定
4.1.3.2 rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+／VP22M~+的筛选与纯化
4.1.3.3 rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+／VP22M~+的PCR鉴定
4.1.3.4 rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+／VP22M~+的Southern blot鉴定
4.1.3.5 rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+／VP22M~+的IFA试验
4.1.3.6 rPRV TK~-／gE~-／VP22E~+／VP22M~+的Western blot鉴定
4.1.4 外源基因的插入对重组病毒在细胞上增殖的影响
4.1.5 重组病毒对BALB／c小鼠的安全性试验
4.1.6 重组病毒免疫BALB／c小鼠对PRV的保护性试验
4.1.7 重组病毒对BALB／c小鼠的免疫试验
4.1.7.1 重组病毒免疫小鼠的抗PRRSV及PRV中和抗体检测
4.1.7.2 重组病毒免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应试验
4.2 PRRS单／双基因及佐剂DNA疫苗的构建及实验免疫研究
4.2.1 单基因及佐剂DNA疫苗表达质粒pCI-VP22ORF5M的构建与鉴定
4.2.2 双基因及佐剂DNA疫苗表达质粒pCI-VP22ORF5M-VP22ORF6的构建与鉴定
4.2.3 IFA检测目的融合蛋白的体外表达
4.2.4 Western blot检测目的融合蛋白的体外表达
4.2.5 DNA疫苗的动物免疫试验
4.2.5.1 DNA疫苗抗E(GP5)特异性ELISA抗体检测
4.2.5.2 DNA疫苗抗PRRSV中和抗体水平检测
4.2.5.3 DNA疫苗的细胞免疫反应检测
第5章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 PRRS新型疫苗靶基因的选择
5.1.2 BHV-1 VP22作为PRRS新型疫苗免疫佐剂
5.1.3 PRRSV的ORFSM基因及BHV-1 VP22基因的克隆与鉴定
5.1.4 PRRS活病毒载体疫苗载体毒株的选择
5.1.5 PRRS单／双基因及佐剂rPRV的构建
5.1.6 外源基因在重组病毒中的表达
5.1.7 外源基因的插入对重组病毒增殖和毒力的影响
5.1.8 PRRS单／双基因及佐剂rPRV诱导实验动物的免疫反应
5.1.9 PRRS DNA疫苗真核表达载体的选择及表达质粒的纯化处理
5.1.10 PRRS单／双基因及佐剂DNA疫苗靶抗原蛋白的表达
5.1.11 PRRS单／双基因及佐剂DNA疫苗诱导实验动物的免疫反应
5.1.12 PRRS新型疫苗的发展前景
5.2 结论
参考文献
致谢
发布时间: 2006-12-12
参考文献
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