论文摘要
研究背景与目的自1997年多莉羊诞生以来,克隆技术得到了广泛的研究并取得了长足的进步,相继获得了克隆牛、小鼠、山羊、猪、猫、马、大鼠和狗等。克隆技术作为一个无性繁殖技术,无论对于科学研究还是畜牧业生产都具有重要的意义：动物克隆技术可以复制优良种畜,挽救濒危动物,克隆与转基因技术和基因敲除技术的结合在人类疾病动物模型的建立方面具有广泛的应用前景。兔是科学研究常用的模式动物之一,繁殖周期短,费用低廉,兔在种属发育中比啮齿类动物更接近于人类；体型适中,在外科手术、血液和代谢研究中比啮齿类动物更具优势,是研究心血管系统、眼科疾病、药物毒性试验和生产抗体的理想实验材料；相对猴而言,应用兔来做研究,不仅成本低,而且在伦理上更为人们所接受。而发展能够从长时间传代培养的细胞系通过核移植获得克隆兔的技术,一直是克隆兔研究的热点。2002年Chesne等利用颗粒细胞获得世界首例克隆兔,Feikun Yang与Qinggang Meng等分别于2007年和2008年利用颗粒细胞获得了克隆兔,我国上海交通大学李善刚等人在2006年利用成体成纤维细胞获得了世界首例成纤维克隆兔,2008年利用胎儿成纤维细胞作为核供体获得了克隆兔。但是目前克隆兔的效率都较低,主要表现克隆兔的成活率不高,通常成活率在1%-3%,并且大部分克隆兔在出生三周内就死亡,能存活到成年并具有繁殖能力的克隆兔非常少。因此,本研究拟利用颗粒细胞和胎儿成纤维细胞作为核供体通过核移植进行克隆兔的研究,为提高克隆兔成活率、建立成熟的克隆兔生产体系。本实验室和中科院广州生物医药与健康研究院合作,为建立一种适合艾滋病研究的动物模型,承担了国家科技部“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项课题：人CD4和CCR5转基因兔作为HIV-1感染的动物模型,其中克隆兔的成功制备是该课题开展的基础。研究方法（一）超数排卵与卵母细胞的制备采用PMSG+HCG方案对新西兰兔进行超数排卵获得卵母细胞：选择拟作供体的雌兔,每只兔皮下注射PMSG 80IU,96h后经耳缘静脉注射HCG 150IU诱导排卵,13h后用预热的M199培养液从输卵管内冲出卵丘卵母细胞复合体（COCs）,将复合体收集到培养液中,最后将所有的复合物用透明质酸酶消化3min使得卵母细胞与颗粒细胞分离呈单个细胞,收集卵母细胞置于培养液中。（二）胎儿成纤维细胞培养和保存体系的建立和颗粒细胞的制备无菌获取15～16日龄的新西兰兔胎儿,经过消化、分离培养、冻存、复苏和传代培养获得胎儿成纤维细胞培养和保存体系；对卵丘卵母细胞复合体进行消化、离心、洗涤获得新鲜的颗粒细胞,核移植前置于4℃C冰箱保存。（三）胚胎的体外发育研究采用激活参数为直流电3.0KV/cm,时长20μs,3次脉冲,每次间隔1s,将卵母细胞进行激活,将激活后形成的孤雌胚胎置于M199、mRD和EBSS-complete三种不同培养液中进行体外培养,并在激活后16h、72h和120h观察孤雌胚胎的发育状况,比较三种培养液对孤雌胚胎发育的影响,筛选出更适合新西兰兔胚胎发育的培养液。（四）胚胎移植方法的建立选择拟作供体的雌兔进行超数排卵后配种。为确保成功排卵,配种后每只兔经耳缘静脉注射HCG 150IU.配种后18～24h从输卵管冲出受精卵并收集到胚胎培养液中,置于38.50℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中,孵育30min后将受精胚胎经输卵管伞部移植到同期发情的代孕兔体内继续发育。（五）颗粒细胞克隆兔体系的建立利用颗粒细胞作为核供体进行核移植,将重构胚进行体外培养,并在激活后16h、72h和120h观察胚胎的发育状况；将处于2～4细胞期的胚胎通过外科手术的方法经输卵管伞部移植到代孕兔的体内继续发育。（六）胎儿成纤维细胞克隆兔体系的建立利用成纤维细胞作为核供体进行核移植,将重构胚进行体外培养,并在激活后16h、72h和120h观察胚胎的发育状况；胚胎移植方法、步骤与颗粒细胞移植方法相同。研究结果（一）超数排卵经用PMSG和HCG组合进行超数排卵处理后的新西兰白兔,每只兔能获得20～30枚卵母细胞。雌性供体兔只要达到性成熟就可以进行超数排卵实验,与达到体成熟后的供体兔相比,前者获得的卵母细胞在数量上与后者没有显著区别,甚至比后者多,但是后者的卵母细胞的质量明显优于前者,主要体现在透明带厚,卵周隙宽及细胞质的颗粒感强的特点。（二）建立胎儿成纤维细胞细胞体外培养和保存体系通过对新西兰兔胎儿成纤维细胞的分离培养、冻存和复苏,发现培养的成纤维细胞能连续传代16代次以上,解冻后的细胞经培养传代,生长良好,从而建立了新西兰兔胎儿成纤维细胞的培养和保存体系。（三）胚胎的体外发育研究孤雌胚胎在体外能发育到囊胚,并可达到90%以上的囊胚率。在不同的培养液中孤雌胚胎的发育存在统计学上的差异,EBSS-complete在72h后囊胚率明显优于M199、mRD。因此,EBSS-complete是适合新西兰兔胚胎体外发育的培养液。（四）熟练掌握胚胎移植方法从超数排卵后配种的供体兔输卵管内冲出的48枚胚胎,并在20min之内移植到3只代孕兔的输卵管内,3只全部怀孕,怀孕率100%,产下21只仔兔,出生仔兔数占移植胚胎数的百分比为43.75%,19只活胎,活胎数占移植胚胎数的百分比为39.58%。（五）颗粒细胞克隆兔体系的建立通过核移植产生的颗粒细胞-卵母细胞重构胚能在体外培养发育到囊胚。通过胚胎移植手术将2～4分裂期的105枚颗粒细胞作为核供体的胚胎移植到6只代孕母兔的输卵管内继续发育。6只代孕受体兔怀孕,到期共产下28只兔仔,妊娠率达100%；得到的仔兔全部发育完全,胚胎发育完全率（出生仔兔占移植胚胎数的百分比）达26.67%；10只成活,胚胎成活率达9.52%。其中3只妊娠到第31天时自然分娩产下14只,活胎7只；其他3只经剖腹产下14只,活胎3只；大部分活胎3d内死亡,仅1只存活至成年。（六）胎儿成纤维细胞克隆兔体系的建立通过核移植产生的胎儿成纤维细胞-卵母细胞重构胚能在体外培养发育到囊胚,将1186枚移植到54只代孕母兔的输卵管内,9只怀孕,怀孕率为16.67%,其中3只受体兔产下5只发育完全的克隆兔,其余6只胚胎发育到20d时退化。小结1、建立了稳定的超数排卵系：利用不同于其他文献剂量的PMSG+HCG,获得了较好的超数排卵结果。2、建立了胎儿成纤维细胞细胞培养和保存体系；3、筛选出适合新西兰兔胚胎体外发育的培养液；4、利用核移植技术成功建立了高效的基于颗粒细胞通过体细胞核移植技术生产克隆兔的体系；5、初步建立胎儿成纤维细胞克隆兔体系。