大菱鲆抗病相关MHC II B等位基因筛选与分析

论文摘要

目前,由于水产业的高速发展,高密度养殖及环境的恶化使水产鱼类病害频发。培育抗病品种,已成为促进水产业发展的一大重要课题。大菱鲆作为我国重要的养殖鱼类,这一难题也急需解决。MHC II B在先天免疫和后天获得性免疫中起着重要作用,并且已有大量研究证明:MHC II B不同等位基因与机体对病原菌的抗性或易感性有着密切关系。所以,我们研究了大菱鲆MHC II B基因的多态性,以及不同等位基因与大菱鲆抗病性之间的关系。1.大菱鲆致病菌的鉴定我们通过16S rDNA序列分析鉴定了大菱鲆致病菌-迟钝爱德华氏菌。该病原菌来自于实验室保存菌株,是在大菱鲆疾病暴发时期,从其腹腔内分离获取的单克隆。利用细菌16S rDNA保守区引物8F和1492R扩增其16S rDNA部分序列,并进行克隆测序。通过测序共获得1505bp的序列,所测三个转化子各不相同。将三条序列到Genbank上比对发现,其与两种细菌相似性最高:Edwardsiella ictaluri和Edwardsiella tarda。通过进化树分析可以发现,我们所得到的序列与Edwardsiella tarda亲缘关系最近,而与Edwardsiella ictaluri相差较远。并且其中一条序列16S rDNA-2与Edwardsiella ictaluri和Edwardsiella tarda序列比对时,其与Edwardsiella tarda有100%的相似度。考虑到细菌16S rDNA多拷贝间的差异以及测序误差在内,因此,可以将大菱鲆病原菌鉴定为迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）。2.大菱鲆MHC II B多态性及其与大菱鲆抗病力的关系通过对大菱鲆MHC II B内含子1和外显子2的序列分析,共发现了4种不同的内含子1（A、B、C和D型）,其不同是由于一19bp重复单元的重复次数不同所致。内含子1的3`端含有一个富含CT/GT的区,该区域为重组酶RecA的潜在识别位点,表明在其演化史中可能发生过重组事件。通过对43个抗病个体中的224条序列和42个易感个体中的214条序列进行MHC II B外显子2分析,共发现了59个不同的等位基因,其中包括35个A型、6个B型、13个C型和5个D型。对其中的25个等位基因进行了抗病群体与易感群体的分布统计分析,部分等位基因在两个群体中都有分布,部分以较低的频率仅出现抗病或易感群体中。等位基因Scma-DBB1*04在抗病群体中出现频率为7%,而在易感群体中出现频率为42.9%,与易感性状相关（p=0.000）;等位基因Scma-DBB2*01在抗病群体中出现频率为44.2%,而在易感群体中出现频率为19%,与抗病相关（p=0.013）相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0. 前言
• 0.1 鱼类免疫系统
• 0.1.1 鱼类的免疫器官和组织
• 0.1.2 鱼类的免疫细胞
• 0.1.3 鱼类体液免疫因子
• 0.1.4 鱼类的免疫应答
• 0.1.5 可提高鱼体免疫力的物质
• 0.2 鱼类抗病相关基因
• 0.2.1 抗菌肽（antimicrobial peptide）
• 0.2.2 天然抗性相关巨噬蛋白1（Natural resistance-associated macrophage protein, Nramp1）
• 0.2.3 NK 细胞增强因子（NK cell enhancement factor，NKEF）
• 0.3 主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex, MHC）
• 0.3.1 鱼类MHC基因的结构特征
• 0.3.2 MHC基因的功能
• 0.3.3 MHC分子的遗传特性
• 0.3.4 鱼类MHC的多态性研究概况
• 0.3.5 鱼类MHC与抗病力的相关性研究概况
• 0.4 本论文的研究目的及意义
• 1. 实验用品
• 1.1 试剂配制
• 1.2 实验仪器
• 2. 大菱鲆病原菌的分离和鉴定
• 2.1 实验步骤
• 2.1.1 大菱鲆病原菌DNA提取
• 2.1.2 大菱鲆病原菌165 rDNA片段的PCR扩增
• 2.1.3 PCR产物回收
• 2.1.4 PCR回收产物与克隆载体连接
• 2.1.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备
• 2.1.6 连接产物转化
• 2.1.7 单克隆检测及测序
• 2.1.8 序列分析
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 大菱鲆病原菌165 rDNA片段的PCR扩增
• 2.2.2 重组子阳性克隆筛选
• 2.2.3 大菱鲆病原菌165 rDNA片段序列分析
• 2.3 讨论
• 3. 大菱鲆感病实验、抗病群体与易感群体的建立及样品采集
• 3.1 大菱鲆实验群体
• 3.2 迟钝爱德华氏菌菌液制备
• 3.3 病菌预感染实验
• 3.4 感染实验
• 3.5 样品采集
• 4. 大菱鲆抗病群体和易感群体MHC II B分析
• 4.1 实验步骤
• 4.1.1 DNA提取
• 4.1.2 引物设计及PCR
• 4.1.3 PCR产物回收
• 4.1.4 PCR产物与克隆载体连接
• 4.1.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备
• 4.1.6 连接产物转化
• 4.1.7 单克隆检测及测序
• 4.1.8 序列分析
• 4.1.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 内含子1 多态性
• 4.2.2 MHC II B 外显子2 多态性分析
• 4.2.3 MHC II B不同等位基因与大菱鲆抗迟钝爱德华氏菌的关系
• 4.3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间完成或参与的文章