耐辐射异常球菌磷酸戊糖途径促进UV诱导的DNA损伤修复

论文摘要

耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans具有对电离辐射、紫外辐射以及其他DNA损伤试剂的极端抗性,拥有超强的DNA损伤修复系统。磷酸戊糖途径（PPP）是细胞各种碳水化合物的代谢枢纽,其代谢中间产物5-磷酸-D-核糖与NADPH提供DNA损伤修复的底物及能量。开展耐辐射异常球菌磷酸戊糖途径的研究,对于探讨细胞辐射抗性机理及其DNA修复能力的机制具有重要的理论意义和应用前景。PPP是生物体生长代谢所必需的,耐辐射异常球菌PPP的研究主要集中该途径第一个酶:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD,zwf编码）,对于该途径其他对于探讨细胞辐射抗性机理酶的研究报道甚少。本研究对G6PD以及转醛酶（TAL）、转酮酶（TKT）在耐辐射异常球菌PPP中的作用和特性进行分析,分别构建了zwf、tal缺失突变株和tkt的部分缺失突变株。通过对突变株生长曲线、代谢谱及UV辐照生存曲线的观察发现,tkt部分缺失导致细胞生长明显变慢且多种碳源利用能力降低,并造成细胞对UV辐射的敏感。zwf、tal缺失对细胞生长和碳源利用无明显影响,但zwf缺失导致细胞对UV的抗性小幅下降;而tal的缺失对UV抗性没有影响。分别对3个突变株及野生型菌株在UV辐照前及UV辐照10 min后细胞内D-核糖与NADPH的含量进行了测定,结果表明未经辐射处理的tal突变株中D-核糖、NADPH的含量与野生型相比没有变化;zwf突变株中D-核糖含量较野生型低,NADPH含量与野生型无差异;但观察到tkt部分缺失突变株中D-核糖、NADPH均发生积累。同时利用real-time PCR对剪切、错配修复途径及PPP、EMP、莽草酸途径等相关基因的转录水平进行分析,结果显示zwf、tal缺失突变株中PPP及其他途径的相关基因在转录水平上无明显变化;而tkt部分缺失突变株中PPP等途径的相关基因的表达产生了明显的变化,特别是PPP中大部分基因转录水平上调。这些结果表明tkt基因在PPP中起更为重要的作用。UV辐照处理10 min后,zwf突变株中D-核糖与NADPH含量与野生型比有所下降,PPP、EMP、莽草酸途径以及剪切、错配修复途径关键基因转录水平均有小幅度上升;Δtkt突变株中D-核糖含量与野生型相比有所上升,但NADPH含量明显下降,PPP、EMP、莽草酸途径以及剪切、错配修复途径关键基因转录水平均明显上升;而在Δtal突变株中,除了D-核糖含量有明显上升外,上述测定的指标均与野生型无明显差异。尽管tal突变引起D-核糖在细胞中的积累,但未改变UV辐射抗性;zwf、tkt突变菌株增强了剪切、错配修复途径等相关基因的转录水平,降低了NADPH的形成。其中Δtkt引起的变化更为突出。不同的是,Δzwf降低了D-核糖的积累,Δtkt则增加了D-核糖的积累。总体分析认为NADPH含量的变化与细胞UV辐射敏感的表型相关。综上所述的研究数据显示,zwf、tkt基因的突变导致细胞生长、EMP、莽草酸等途径相关基因表达及辐射抗性的改变,其编码产物是PPP的关键酶。PPP所产生的NADPH作为细胞还原力的主要来源在细胞UV诱导损伤的修复中起主要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 耐辐射微生物的概述
• 1.2 耐辐射异常球菌
• 1.2.1 D. radiodurans生长情况及细胞结构
• 1.2.2 D. radiodurans的遗传学特性
• 1.2.3 D. radiodurans辐射及其他胁迫抗性
• 1.3 D. radiodurans的DNA损伤修复机制
• 1.3.1 剪切修复
• 1.3.2 错配修复
• 1.3.3 重组修复
• 1.4 D. radiodurans代谢系统
• 1.4.1 糖类代谢
• 1.4.2 氨基酸核酸代谢
• 1.5 磷酸戊糖途径
• 1.6 磷酸戊糖途径影响D. radiodurans辐射抗性相关研究基础
• 1.7 立题依据及技术路线
• 第二章 PPP突变株的构建及表型鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验菌株与质粒来源
• 2.1.2 酶、试剂盒及生化试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 培养基及主要试剂溶液的配置
• 2.1.5 细菌培养
• 2.1.6 基因组DNA、质粒DNA的提取
• 2.1.7 D. radiodurans线性转化
• 2.1.8 E. coli感受态细胞的制备与热激转化
• 2.1.9 PCR引物与反应条件
• 2.1.10 DNA片段的回收、纯化、酶切与连接
• 2.1.11 以Δtkt基因组为模板的real-time PCR反应引物、体系及反应条件
• 2.1.12 细菌总RNA的提取及DNase的消化
• 2.1.13 RNA反转录为cDNA
• 2.1.14 生长曲线的测定
• 2.1.15 UV辐照存活曲线的测定
• 2.1.16 伽马辐照存活曲线的测定
• 2.1.17 D. radiodurans野生型及磷酸戊糖途径突变株代谢谱分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 D. radiodurans Δzwf, Δtal突变株阻断片段的构建
• 2.2.2 D. radiodurans Δzwf, Δtal突变株的纯化与验证
• 2.2.3 D. radiodurans Δtkt突变株阻断片段的构建
• 2.2.4 D. radiodurans Δtkt 突变株的纯化及突变率测定
• 2.2.5 生长曲线测定
• 2.2.6 UV辐照存活率测定及存活曲线绘制
• 2.2.7 伽马辐照存活率测定及存活曲线绘制
• 2.2.8 突变株代谢谱分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 突变株的构建与验证
• 2.3.2 突变株表型测定
• 第三章 磷酸戊糖途径突变对其他代谢通路的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 酶、主要试剂及试剂盒
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 Real-time PCR引物、体系及反应条件
• 3.1.4 UV辐照处理
• 3.1.5 细菌细胞破碎及破碎效率测定
• 3.1.6 高效液相色谱检测细胞内液中D-ribose含量
• 3.1.7 细胞内液中NADPH含量测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 突变株PPP基因UV处理前后转录水平变化
• 3.2.2 突变株中NER, MMR基因UV处理前后转录水平变化
• 3.2.3 突变株中EMP, SAP基因UV处理前后转录水平变化
• 3.2.4 D. radiodurans突变株细胞中D-ribose含量变化
• 3.2.5 D. radiodurans突变株细胞内液中NADPH含量变化
• 3.3 讨论
• 3.3.1 zwf, tal, tkt基因的突变在UV辐照处理前后对PPP的影响
• 3.3.2 PPP对于UV抗性的影响
• 第四章 结论
• 附录一 株耐辐射新菌的分离与鉴定
• 1 材料方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介