论文摘要
目的:以H2O2损伤PC12细胞为神经细胞氧化应激损伤的模型,探讨硫化氢（hydrogen sulfide, H2S）对神经细胞氧化应激损伤的保护作用,并初步探讨硫化氢抗神经细胞氧化应激损伤的机制。方法:用普通光镜和Hoechst 33258荧光染色观察H2O2作用24h后PC12细胞形态和核形态的变化;用四甲基偶氮唑蓝（3-（4,5-Dimethylthiazol-2yl）-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide,MTT）比色法检测细胞增殖状况;DNA Ladder抽提试剂盒和碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色流式细胞术（flow cytometry, FCM）检测细胞凋亡;双氢罗丹明123（Dihydrohodamine 123, DHR123）染色后,镜下观察和FCM测定PC12细胞的DHR123荧光强度,以明确细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）含量的变化情况;罗丹明123（Rhodamine 123, Rh123）染色后,镜下观察和FCM测定PC12细胞的Rh123荧光强度,以了解细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,△Ψm）的变化情况;Western Blot检测细胞Bcl-2和Caspase-3蛋白质的表达。结果:1.H2O2对PC12细胞的氧化应激损伤作用:①MTT结果显示,用不同剂量H2O2（50、100、200、400、600μmol/L）作用PC12细胞24h后,细胞存活率随药物浓度的增加依次下降。②普通光学显微镜下观察发现,与正常细胞比较,细胞经H2O2（ 200、400μmol/L ）处理24h后,细胞数明显减少,细胞形态多为圆形,体积缩小,折光性减弱,贴壁能力降低。③细胞经Hoechst 33258染色后,在荧光显微镜下观察发现,正常PC12细胞染色质分布均匀,为弥漫均匀的低强度荧光;经H2O2（ 200、400μmol/L ）处理24h后,PC12细胞有大量的细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞。④细胞经PI染色FCM结果显示,PC12细胞自然凋亡率为3.2%,经200和400μmol/L H2O2处理24小时后,分别可引起28.4%和45.1%的细胞凋亡（P<0.01）。2.H2S对H2O2损伤PC12细胞的保护作用2.1 H2S减轻H2O2对PC12细胞活性的抑制作用①MTT结果显示,400、800μmol/L NaHS均可明显降低200、400μmol/L H2O2对PC12细胞的抑制率（P<0.05）。②普通光学显微镜观察发现,与H2O2（200μmol/L ）损伤组比较,合用NaHS（400μmol/L）处理后,圆形的,体积缩小的,折光性减弱,贴壁能力降低的PC12细胞数量明显减少。2.2 H2S对抗H2O2诱导PC12细胞凋亡①DNA Ladder结果显示,200μmol/L H2O2作用PC12细胞24h后,细胞的DNA被裂解,在琼脂糖凝胶电泳图上呈现典型的梯形条带,合用400μmol/L NaHS处理后能明显抑制DNA梯带的形成。②Hoechst 33258染色荧光显微镜观察发现,与H2O2（200μmol/L）损伤组比较,合用NaHS （400μmol/L）处理的PC12细胞中细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的细胞数明显减少,大部分细胞染色质呈弥漫均匀的低强度荧光。③FCM结果显示,400和800μmol/L NaHS均可明显抑制200和400μmol/L H2O2对PC12细胞凋亡的诱导作用（P<0.05）。3.H2S抗PC12细胞氧化应激损伤的作用机制①PC12细胞经DHR123染色后,荧光显微镜观察发现,200μmol/L H2O2孵育PC12细胞3h后,合用400μmol/L NaHS处理的PC12细胞的DHR123荧光强度较200μmol/L H2O2损伤组明显减弱;FCM定量分析结果显示,合用400μmol/L NaHS处理的PC12细胞的DHR123平均荧光强度（8.03±2.08）较200μmol/L H2O2损伤组（13.81±2.52）明显降低（P<0.01）。表明H2S对H2O2诱导细胞内ROS的生成具有抑制作用。②PC12细胞经Rh123染色后,荧光显微镜观察发现,200μmol/L H2O2孵育PC12细胞6h后,合用400μmol/L NaHS处理的PC12细胞的Rh123荧光强度较200μmol/L H2O2损伤组明显增强;FCM定量分析结果显示,合用400μmol/L NaHS处理的PC12细胞的Rh123平均荧光强度（16.13±9.5）较200μmol/L H2O2损伤组（10.2±5.57）明显升高（P<0.01）。表明H2S对H2O2降低PC12细胞的△Ψm具有抑制作用。③Western Blot结果显示,200μmol/L H2O2孵育PC12细胞24h后,与正常对照组相比,Bcl-2蛋白的表达明显减少,合用400μmol/L NaHS能显著减轻H2O2对Bcl-2蛋白表达的抑制作用。④Western Blot结果显示,200μmol/L H2O2孵育PC12细胞24h后,与正常对照组相比,Caspase-3蛋白的表达明显增加;合用400μmol/L NaHS后,与H2O2损伤组比较,PC12细胞的Caspase-3蛋白的表达明显降低。结论:1. H2S对H2O2诱导的PC12细胞氧化应激损伤具有保护作用;2. H2S对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用可能与其抑制H2O2作用后细胞内ROS水平的升高,细胞△Ψm和Bcl-2表达的下降以及Caspase-3表达的增加有关。
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