白灵菇分类地位的评估及遗传多样性分析

论文摘要

本文针对前人在侧耳属分类研究中未曾将中国的白灵菇和典型的Pleurotus nebrodensis进行比较分析的缺陷,对来自中国的白灵菇菌株和来自欧洲的Pleurotus nebrodensis, Pleurotus ferulae, Pleurotus eryngii, Pleurotus elaeoselini菌株进行DNA分子标记（ITS, IGS2, SRAP）分析,从分子水平为白灵菇分类地位的确定提供可靠依据,同时研究了各侧耳种的系统发育关系和遗传多样性。主要研究结果如下：1、菌丝体形态和菌丝生长速度实验观察结果：PN802（1号）和PN803（2号）菌株在生长后期会产色素与其他供试菌株有明显的差异,但二者根据菌丝形态特征难以区分；菌株KH5（15号）、PF ds 264（17号）、PF 882（18号）的菌丝形态也与其它菌株明显不同,说明这些菌株与其他供试菌株的遗传背景有明显差异。其余供试菌株的菌丝体形态也有一定差异,但是组内各菌株无法区分。根据菌丝体生长速度数据,无法将供试菌株分类,但从数据中可以看出KH2（14号）和PF 882（18号）菌株的生长速度显著快于其他菌株,说明这两株菌株与其他供试菌株的遗传差异较大。中国的白灵菇菌株比欧洲的Pleurotus nebrodensis菌株生长速度快,Pleurotus eryngii和Pleurotus elaeoselini菌株的菌丝体生长速度比其他侧耳种快。2、菌丝体拮抗反应试验结果：来自中国的绝大多数白灵菇菌株PN 2, PN sn 1, PN sn 2, PN sn 4, PN ts 1, PN ts 2, PN1 （8、9、10、11、12、13和33号）分在一组,PN802（1号）和PN803（2号）两株Pleurotus nebrodensis菌株分在一组,这与菌丝体形态特征观察的结果一致。PE ds 77, PE ds 359, PE4（27、28和32号）菌株分在一组,它们均为Pleurotus eryngii。3株Pleurotus elaeoselini菌株EL 759,EL 738,EL 720（22、23和24号）分在一组。其它菌株各自独立成组。结果表明拮抗试验可以作为侧耳初步分类的方法。3、对ITS序列进行比对分析,结果显示全部供试菌株的ITS序列长度范围为534～589bp。从序列长度变异来看,ITS1区序列长度变化范围为184～255bp,稍大于ITS2区的180～200bp；5.8S序列相对保守,只有154bp和158bp两种长度。所有侧耳菌株无论是ITS1区还是ITS2区（G+C）%都比较低,ITS1平均为42.5%,ITS2平均为43.9%,G+C含量低说明其碱基置换具有很大的随机性。基于ITS序列信息,构建了34株供试菌株的系统发育树,结果显示：白灵菇与Pleurotus nebrodensis具有很近的亲缘关系,Pleurotus nebrodensis菌株的多态性更丰富；多数Pleurotus eryngii菌株聚在一组；3株Pleurotus elaeoselini聚在一起；Pleurotus ferulae菌株没有独立聚为一组。4、用4种识别四个碱基的内切酶对供试菌株进行IGS2-RFLP分析,其中3种酶的酶切效果较好。结果显示：每个菌株均存在3种酶的酶切位点,电泳后产生不同的带型。HaeⅢ酶切后产生21条条带,HhaⅠ酶切后产生13条条带,RsaⅠ酶切后产生19条条带,共计53条,其中多态性条带为52条,多态性比率为98%。3个内切酶都不能单独将全部供试菌株区别开,3种酶共同使用时,PN802（1号）和PN803（2号）两个菌株不能区分开,PN sn 1, PN sn 2, PN sn 4 and PN ts 2（9、10、11和13号）菌株不能区分开。根据IGS2-RFLP的信息构建系统发育树,结果与基于ITS构建的系统发育树显示的结果基本一致,不同的是3株Pleurotus elaeoselini没有聚在一起。5、用筛选出的7对扩增条带清晰、多态性丰富、稳定性好的引物组合对34株供试菌株进行SRAP扩增,共得到420条具有重复性的条带,且均为多态性条带,多态性比率为100%。每对引物的扩增效率不同,扩增条带数目为53-71条不等,平均每对引物扩增出60条条带,其中F1-R4扩增条带数最多,为71条条带。基于SRAP标记信息,构建了供试菌株的系统发育树,聚类分析结果与ITS基本一致,表明SRAP标记可以作为侧耳菌株分类和遗传多样性分析的有效技术手段。6、三种DNA分子标记分析结果表明,在一定相似性水平上,白灵菇与Pleurotus nebrodensis有很近的亲缘关系,二者很可能为同一菌种；Pleurotus nebrodensis菌株的多态性较白灵菇菌株丰富,说明中国的白灵菇菌株的遗传背景较单一；供试的Pleurotus ferulae菌株不能聚在一组,各菌株之间遗传差异较大；SRAP标记技术可以作为侧耳菌株分类及遗传多样性研究的有效手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 一、白灵菇的概述
• 1 白灵菇的营养价值和药用价值
• 2 白灵菇分类的国内外研究进展
• 二、分子生物学技术在食用菌分类和系统发育研究中的应用
• 1 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 2 随机扩增多态性DNA（RAPD）
• 3 扩增片段长度多态性（AFLP）
• 4 内部转录间隔区（ITS）和转录单位间隔区（IGS）
• 5 内部简单重复序列（ISSR）
• 6 相关序列扩增多态性（SRAP）
• 三、研究目的和意义
• 第二章 白灵菇及其来自欧洲的近缘种的形态学鉴定
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 4 小结与讨论
• 第三章 白灵菇及其来自欧洲的近缘种的分子生物学分类鉴定
• 第一节 ITS序列分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 4 小结与讨论
• 第二节 IGS2-RFLP分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 4 小结与讨论
• 第三节 SRAP分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果与分析
• 4 小结与讨论
• 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录