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芦荟汁中胶原酶抑制成分的分离纯化与抑制作用研究

2020-12-01阅读(172)

芦荟汁中胶原酶抑制成分的分离纯化与抑制作用研究

论文摘要

本论文主要对芦荟汁中胶原酶活性抑制成分进行了研究,包括胶原酶活性和抑制剂抑制效果测定方法、芦荟汁干粉中有效抑制成分的分离纯化、结构鉴定与抑制效果测定,初步探讨了可能的抑制机理并进一步寻找到其它具有抑制作用的植物提取物。实验首先研究了羟脯氨酸化学比色法的影响因素,确定实验条件:1.0mL待测溶液中加入2.0mL异丙醇,1.0mL氧化剂氧化5min,再加入2.0mL显色剂,60℃加热显色20min,冰浴冷却5min后测定561nm处的吸光度,根据标准曲线法计算羟脯氨酸质量。以羟脯氨酸含量测定为检测手段,初步研究了胶原酶对胶原蛋白的酶解反应过程,并在此基础上设计了胶原酶活性及抑制剂抑制效果测定方法:胶原蛋白10mg,胶原酶液浓度0.1mg/mL,反应温度37.0℃;Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷-盐酸）缓冲溶液中胶原酶催化降解固态不溶性胶原蛋白分解为可溶性肽进入溶液,反应终止后滤除未反应胶原蛋白,滤液加浓盐酸密封加热酸解后测定其中游离羟脯氨酸的质量;抑制剂与空白实验的羟脯氨酸质量差值体现出抑制剂的抑制效果。实验发现芦荟汁干粉中蒽醌苷类化合物具有明显的胶原酶抑制效果;芦荟汁干粉先用热水煎煮,滤液经乙酸乙酯萃取,除去溶剂后得粗提取物;该粗提取物再经硅胶柱层析分离多次,得到含有两种主要物质的混合物;最后经半制备高效液相色谱分离出两种纯物质;经定性实验和HPLC、UV、IR、MS、1H NMR谱图鉴定化学结构,分别确定为芦荟素和异芦荟素。抑制效果测定结果表明两者具有相似的抑制效果并随质量浓度的增大而近似线性升高,1mg/mL时百分抑制率分别达到42.4%和35.0%,低浓度下的抑制效果高于常见抑制剂四环素。根据文献中胶原酶抑制机理——Zn2+螯合理论,初步分析认为芦荟素、异芦荟素可能也符合该理论,抑制作用可能与其分子结构有关;后续实验还发现芍药、川芎提取物也具有胶原酶抑制效果。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 引言
  • 1.1 胶原蛋白与胶原酶简介
  • 1.1.1 胶原蛋白
  • 1.1.2 胶原酶
  • 1.2 胶原酶活性与羟脯氨酸测定方法简介
  • 1.2.1 胶原酶活性测定方法
  • 1.2.2 羟脯氨酸测定方法
  • 1.3 胶原酶抑制剂
  • 1.3.1 胶原酶抑制剂的应用价值
  • 1.3.2 胶原酶抑制剂的研究进展
  • 1.4 小结
  • 1.5 立题依据与主要研究内容
  • 第二章 羟脯氨酸化学比色法
  • 2.1 基本原理
  • 2.2 试剂与仪器
  • 2.3 试剂配制
  • 2.4 影响因素考察
  • 2.4.1 氯氨T 氧化时间
  • 2.4.2 加热显色时间
  • 2.4.3 羟脯氨酸溶液pH 值
  • 2.4.4 指示剂的干扰
  • 2.4.5 抑制剂的干扰
  • 2.5 羟脯氨酸含量测定方法2.5.1 实验操作
  • 2.5.1 实验操作
  • 2.5.2 羟脯氨酸标准曲线
  • 2.5.3 测定结果的精确度
  • 2.6 胶原蛋白中羟脯氨酸含量的测定方法
  • 2.7 胶原酶对胶原蛋白降解反应的初步研究
  • 2.7.1 基本原理
  • 2.7.2 实验操作
  • 2.7.3 胶原蛋白加入量和胶原酶液质量浓度
  • 2.7.4 反应时间和降解率的关系
  • 2.8 胶原酶抑制剂抑制效果测定方法
  • 2.8.1 基本原理
  • 2.8.2 测定方法
  • 2.8.3 表示方法
  • 2.8.4 四环素的抑制效果测定
  • 2.9 小结
  • 第三章 胶原酶抑制成分的分离纯化与抑制效果测定
  • 3.1 试剂与仪器
  • 3.2 已知抑制剂化学结构分析和目标提取物的选择
  • 3.3 芦荟、芦荟素和蒽醌苷分离方法简介
  • 3.3.1 芦荟
  • 3.3.2 芦荟素
  • 3.3.3 蒽醌苷分离方法
  • 3.4 芦荟汁中有效成分的分离提取
  • 3.4.1 试剂配制
  • 3.4.2 分离提取方法
  • 3.4.3 HPLC 分析
  • 3.4.3.1 HPLC 分析条件
  • 3.4.3.2 芦荟素标准曲线
  • 3.4.3.3 有效组分的HPLC 图谱
  • 3.4.3.4 半制备高效液相色谱分离
  • 3.4.3.5 各步骤收率与纯度
  • 3.5 定性分析
  • 3.5.1 Borntrager’s 反应（鉴定羟基蒽醌类化合物）
  • 3.5.2 芦荟苷反应
  • 3.5.3 硼酸荧光反应
  • 3.5.4 醋酸镁反应
  • 3.5.5 薄层层析（TLC）
  • 3.6 化学结构鉴定
  • 3.6.1 m.p
  • 3.6.2 UV（MeOH）
  • 3.6.3 IR（KBr 盐片）
  • 3.6.4 LC－MS
  • 1H NMR（丙酮－d6）'>3.6.51H NMR（丙酮－d6）
  • 3.7 芦荟素、异芦荟素的抑制效果测定
  • 3.8 小结
  • 第四章 抑制机理初步探索和其它植物提取物
  • 2+螯合理论简介'>4.1 ZN2+螯合理论简介
  • 4.2 芦荟素、异芦荟素抑制机理实验
  • 4.3 其它具有胶原酶抑制作用的植物提取物
  • 4.3.1 芍药粗提取物
  • 4.3.2 川芎粗提取物
  • 4.3.3 抑制效果测定
  • 第五章 总结与展望
  • 一、羟脯氨酸化学比色法及抑制效果测定方案
  • 二、 有效成分的提取、结果鉴定和抑制效果测定
  • 三、抑制机理探索及其它植物提取物
  • 四、展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 作者在攻读硕士学位期间发表的文章
  • 附录

    • 相关论文文献

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